eksperimentet
som præsenteret i problemløsningstesten i den sidste udgave af biokemi og molekylærbiologisk uddannelse reguleres transkriptionsenheden , der koder for tryptophanbiosyntesen, af trp1‐repressoren, som er en mekanisme til at: en af de mest almindelige årsager til, at tryptophan-gener er TRP E, D, C, B og tryptophan-gener, er, at det er en af de mest almindelige typer af tryptophan-gener, der er forbundet med transkriptionen af TRP E, D, C, B og tryptophan-syntese. Denne hæmning er imidlertid” utæt”: der er en vis transkription af operonen, selv i nærvær af tryptophan; dette ville spilde energi til at producere ikke nødvendige. En anden reguleringsmekanisme, kaldet dæmpning, slår ned denne resterende transkription på trp-operonen .
en kort region mellem operatøren og det første strukturelle gen (trp E), kaldet leder (Fig. 1), er ansvarlig for dæmpning. Ledersekvensen er en lang basepar på 140 og koder for 5 ‘ – end-regionen af trp mRNA forud for initieringskodonet for det første strukturelle gen. Leader-regionen i trp mRNA har en unik struktur (Fig. 2a). Den indeholder en kort åben læseramme (ORF), der koder for et oligopeptid kaldet leader peptid. To palindromiske sekvenser (region 1/2 og region 3/4) producerer selvkomplementær baseparring, der fører til dannelsen af hårnålestrukturer. Den anden hårnål (region 3/4) efterfølges af en strækning af os, hvilket skaber en strukturel Karakteristik af visse transkriptionsterminatorer. ORF-kodningen for leader-peptidet overlapper med region 1 og indeholder to kodoner for tryptophan. Desuden supplerer Region 2 og 3 ikke kun henholdsvis Region 1 og 4, men også hinanden. Denne ret komplicerede struktur af ledersekvensen sætter scenen for en genial reguleringsmekanisme til transkriptionen af operonen.
Fig. 1. Strukturen af tryptophan operon af E. coli.(P, promotor; o, operatør; L, leder; E, D, C, B og A, strukturelle gener. Figuren er ikke tegnet i skala: P, O og L regioner er meget kortere end proteinkodende gener.)
Fig. 2. Dæmpning i reguleringen af trp operon af E. coli. a) strukturen i 5’‐end-regionen af trp mRNA. B) lempelse af dæmpningen i lavtryptofanmedium. (c) tidlig afslutning (dæmpning) af trp‐transkription i højtryptofanmedium (for detaljer se teksten).
dæmpning er baseret på koblet transkription / oversættelse i prokaryoter: ribosomer binder til spirende mRNA ‘ er, der danner kromosom–polysom-komplekser; således starter proteinsyntese på voksende mRNA-kæder. Hvis tryptophan ikke er tilgængelig (Fig. 2b), ribosomet boder i lederen peptid kodende ORFs forstyrre hårnål 1/2 og fører til dannelsen af hårnål 2/3. Denne hårnål forhindrer dannelsen af termineringshårnålen 3/4 (kaldet dæmperen), og RNA‐polymerase er således i stand til at fortsætte forlængelsen og transkriberer hele operonen til et transkript i fuld længde. Men hvis tryptophan er til stede, fortsætter ribosomet med at bevæge sig og forhindrer dannelsen af både hårnål 1/2 og 2/3 (Fig. 2c). Dæmperen hårnål 3/4 kan danne og afslutter transskription. Lederpeptidet og det korte leder-RNA nedbrydes derefter hurtigt, og de strukturelle gener transkriberes ikke. Gennemgå mekanismen og løse følgende test.
i dette fiktive eksperiment anvendes to trp operonmutanter: i en af dem blev de to UGG-kodoner, der koder for tryptophan, konverteret til GGG ‘ er (kodoner for glycin; betegnet “trp codon mutant” i hele testen); i den anden blev region 3 slettet (“region 3 mutant”).
vildtype E. coli-celler,” trp-kodonmutanter “og” region 3-mutanter ” dyrkes i et rigt medium, der indeholder alle aminosyrer (inklusive tryptophan) i optimale koncentrationer. Hvad sker der med dem?
Eksperimentanalyse
- (a)
hvis erklæringen understøttes af de givne oplysninger;
- (b)
hvis erklæringen modsiges af de givne oplysninger;
- (c)
hvis erklæringen hverken understøttes eller modsiges af de givne oplysninger.
- 1)
_____ “Trp codon mutant” celler dør.
- 2)
_____ vildtype celler vokser hurtigst.
- 3)
_____ “Region 3 mutant” celler vokser langsomst under sådanne forhold.
- 4)
_____ kromosom–polysom-komplekser dannes på trp-operonen i alle tre celler.
- 5)
_____ Tryptophan syntetiseres kun i signifikante mængder i “region 3 mutant” celler.
- 6)
_____ Ved anvendelse af et TRP‐leder-DNA-fragment som en sonde identificerer Northern blot-analyse af cellulært RNA i “trp-kodonmutanter” et stærkt bånd svarende til et 140-nukleotid-RNA.
- 7)
_____ Ved hjælp af den samme sonde detekteres store mængder trp‐operontranskripter i fuld længde i vildtype celle‐RNA-prøver.
de samme celler dyrkes nu i et medium, der indeholder alle aminosyrerne undtagen tryptophan. Hvordan opfører cellerne sig under sådanne forhold?
Eksperimentanalyse
- (a)
hvis erklæringen understøttes af de givne oplysninger;
- (b)
hvis erklæringen modsiges af de givne oplysninger;
- (c)
hvis erklæringen hverken understøttes eller modsiges af de givne oplysninger.
- 8)
_____ “Trp codon mutant” celler dør.
- 9)
_____ Vildtypeceller vokser hurtigst.
- 10)
_____ “Region 3 mutant” celler vokser langsomst under sådanne forhold.
- 11)
_____ kromosom–polysom-komplekser dannes på trp-operonen i alle tre celler.
- 12)
_____ Tryptophan syntetiseres kun i signifikante mængder i “region 3 mutant” celler.
- 13)
_____ Ved anvendelse af et TRP‐leder-DNA-fragment som en sonde identificerer Northern blot-analyse af cellulært RNA i “trp-kodonmutanter” et stærkt bånd svarende til et 140-nukleotid-RNA.
- 14)
_____ Ved hjælp af den samme sonde detekteres store mængder trp‐operontranskripter i fuld længde i vildtype celle‐RNA-prøver.