presynaptisk hyperpolarisering inducerer en hurtig analog modulering af spike-fremkaldt transmission medieret af aksonal natriumkanaler

Hyperpolariseringsinduceret ad-facilitering

vi målte først forekomsten af kort hyperpolarisering af den presynaptiske celle ved synaptisk transmission. Par af monosynaptisk forbundne CA3-neuroner blev registreret i organotypiske kulturer af rottehippocampus efter 8-10 dage in vitro (DIV)21. En 200 ms hyperpolariserende præpuls leveret før den presynaptiske spike viste sig at øge synaptisk styrke med 20% (Fig. 1a). Denne stigning blev observeret ved måling af enten amplitude eller ladning af det postsynaptiske respons (supplerende Fig. 1). I disse eksperimenter var det presynaptiske hvilepotentiale -74 liter 3 mV (n=10). H-ADF var sammenlignelig, når den presynaptiske hyperpolarisering udgjorde -84 eller -102 mV (henholdsvis 124 liter 8% versus 119 liter 5%, n=10; test P>0.1), hvilket tyder på, at en presynaptisk hyperpolarisering af kr10 mV er tilstrækkelig til at opnå mættende h-ADF. h-ADF var forbundet med et reduceret parret pulsforhold (PPR, fra 99 liter 7 til 88 liter 5%, n=12; test P<0,05; supplerende Fig. 1), hvilket indikerer, at det skyldes en presynaptisk stigning i glutamatfrigivelse.

en 200-ms-lang hyperpolarisering er usandsynligt at forekomme i en fysiologisk sammenhæng. Derfor undersøgte vi tidsforløbet for h-ADF for kortere hyperpolariseringer (15, 50, 100 og 200 ms). h-ADF blev observeret for alle de testede varigheder af hyperpolarisering (15 ms: 111 3%, 50 ms: 116 4%, 100 ms: 109 4%, 200 ms: 120 6%, P<0,05 for alle varigheder, n=7, Fig. 1b). Ifølge dette resultat induceres h-ADF sandsynligvis ved fysiologisk hyperpolarisering.

CA3 pyramidale neuroner udtrykker depolariseringsinduceret ad-facilitering (d-ADF), der skyldes den langsomme inaktivering af Kv1.1-kanaler (tidskonstant: 3,3 s)13. Vi undersøgte således, om både d – og h-ADF blev udtrykt ved de samme CA3–CA3-forbindelser. Presynaptic APs blev udløst alternativt fra hvilemembranpotentiale (-78 mV-kontrol) efter en lang undertærskel depolarisering (10 s, -62,6 mV, d-ADF) efter en kort hyperpolarisering (200 ms, -96,1 mV, h – ADF) eller efter kombinationen af en lang depolarisering og en kort hyperpolarisering (D-og h-ADF; Fig. 1C, venstre). Faktisk frembragte kombinationen af de to former for ADF i de samme forbindelser en større lettelse (113 liter 3%, n=16; Fig. 1c) end den, der produceres separat ved hver protokol (d-ADF alene: 105 liter 3%, n=16, h-ADF alene: 108 liter 4%, n=11; Fig. 1c). Især blev gennemsnit h-og d-ADF fundet at summere lineært, hvilket tyder på to uafhængige molekylære mekanismer. Desuden blev d-og h-ADF målt i de samme par positivt korreleret (supplerende Fig. 1), hvilket antyder, at nogle synaptiske forbindelser er mere modtagelige for ad-lettelse, sandsynligvis fordi Analog signaludbredelse langs aksonet afhænger af afstanden mellem soma og de presynaptiske terminaler. Disse data viser, at h – og d-ADF eksisterer sammen i CA3 pyramidale neuroner, og at de underliggende mekanismer sandsynligvis er uafhængige.

h-ADF blev observeret i unge CA3–neuroner (DIV8–10 fremstillet ud fra P5-P7-rotter), og det kunne således hovedsageligt skyldes lavdensitets-eller umodne egenskaber af spændingsstyrede ionkanaler. Vi bestemte derfor, om h-ADF også blev fundet i modne CA3 pyramideceller. Parrede optagelser af tilsluttede CA3–neuroner blev opnået i div24-DIV32 skivekulturer. Kort presynaptisk hyperpolarisering (200 ms) øgede signifikant synaptisk styrke (104.2 til 1,1% n=25; p<0,01; supplerende Fig. 2). h-ADF målt i modne celler var mindre end målt i udviklende neuroner (Mann–Hvidney, P<0,01; supplerende Fig. 2). Vi konkluderer derfor, at h-ADF er udviklingsreguleret i CA3 neuroner in vitro.

alle optagelser blev opnået med højt ekstracellulært calcium (3 mM) for at optimere synaptisk styrke. Under disse forhold er sandsynligheden for presynaptisk frigivelse høj, og presynaptisk lettelse såsom h-ADF kunne undervurderes. Vi målte derfor h-ADF i modne CA3-neuroner (DIV24–DIV32) registreret med fysiologisk ekstracellulært calcium (1,3 mM)22. Under disse forhold viste h-ADF sig at være omkring +16,4% (p<0,01; supplerende Fig. 2). Vi konkluderer, at h-ADF udtrykkes robust i modne neuroner registreret i fysiologisk ekstracellulært calcium.

h-ADF induceres af simulerede IPSP ‘ er og svingninger

for at undersøge h-ADFS rolle under næsten fysiologiske forhold blev en GABAA-lignende konduktans introduceret i den presynaptiske neuron ved hjælp af dynamisk klemme (Fig. 2A, venstre). I overensstemmelse med resultaterne illustreret i Fig. 1, APs forud for injektionen af en IPSC – lignende strøm frembragte et større respons i den postsynaptiske neuron sammenlignet med APs udløst fra hvilemembranpotentiale (<0,001, n=11). I overensstemmelse med en præsynaptisk forhøjelse i glutamatfrigivelse blev PPR reduceret, når simulerede GABAergiske IPSP ‘ er gik forud for APs (fra 121% i kontrol til 96%; p<0,05, n=7; data ikke vist). Interessant nok viste størrelsen af den synaptiske potentiering sig at være afhængig af størrelsen af den simulerede IPSP (R2=0,39, P<0,05), hvilket indikerer, at h-ADF er klassificeret mellem hvilemembranpotentiale (-74 mV) og 10-mV hyperpolarisering (-84 mV; Fig. 2a, højre). Faktisk blev faciliteringsfaktoren i dette interval fundet at være 1,8% pr.

Vi undersøgte derefter moduleringen af synaptisk styrke under presynaptisk membranpotentialoscillation. Oscillation af det presynaptiske membranpotentiale ved 4 HS blev produceret ved injektion af sinusformet strøm, og enkelte presynaptiske pigge blev fremkaldt i forskellige faser af svingningen. I overensstemmelse med de tidligere resultater blev h-ADF observeret, når cellen fyrede under hyperpolariserende faser af oscillationen (0 ms: 124,3 liter 7%, 250 ms: 122 liter 7%, Vilokson P<0,05, n=8; Fig. 2b). I andre faser er den synaptiske styrke uændret (56 ms: 112,2 liter 6%, 163 ms: 95,8 liter 5%, 211 ms: 110,5 liter 6%, Vilkson p>0,1, n=8). Især observeres ingen d-ADF med depolariseringen, fordi dens varighed er for kort til at inaktivere Kv1.1-kanaler13. Vi konkluderer, at svingninger i kur-området inducerer h-ADF i CA3-neuroner.

h-ADF er forbundet med en stigning i aksonal spike amplitude

dernæst undersøgte vi mekanismerne bag h-ADF. En mulig mekanisme til h-ADF er en modulering af den presynaptiske spidsamplitude induceret af hyperpolariseringen. Vi undersøgte derfor konsekvensen af hyperpolarisering på spidsamplituden målt i aksonet. CA3-neuroner blev fyldt med Aleksa 488 (50 liter) for at visualisere aksonarboriseringen, og cellebundne optagelser blev opnået fra aksonet i afstande mellem 60 og 240 liter (Fig. 3a). Ved somatisk hyperpolarisering blev amplituden af den aksonale spids forbedret (106 liter 1% af kontrolamplituden, n=6, Vilkson, P<0,05; Fig. 3b). Størrelsen af aksonal spidsfacilitering viste sig imidlertid at falde med den aksonale afstand med en rumkonstant på 212 liter (Fig. 3b). Afslutningsvis er h-ADF i CA3-neuroner forbundet med en lokal stigning i spidsamplitude i aksonet.

mens helcelleoptagelse fra CA3-aksoner er ekstremt vanskelig i organotypiske kulturer, kan den opnås i L5 pyramidale neuroner fra akutte skiver5,6. Derfor målte vi først, om h-ADF også kunne observeres ved L5–L5 ophidsende forbindelser. Par af monosynaptisk forbundne L5 pyramidale neuroner blev registreret i akutte skiver fra sensori-motorbarken hos unge rotter (P14–P20). Kort hyperpolarisering i Soma (200 ms, 10-15 mV) af den presynaptiske neuron viste sig at forbedre synaptisk styrke (109,6 liter 2,3%, N=13, test, P<0,05; Fig. 4a).

for at bekræfte, at h-ADF i L5 pyramidale neuroner var forbundet med aksonal stigning i spidsamplitude, blev der opnået samtidige helcelleoptagelser fra soma og cut-end aksoner (blebs) (50-80 liter fra soma) i L5 pyramidale neuroner. Transient hyperpolarisering af soma (ca.-13 mV) forbedrede amplituden af spidsoverskuddet i aksonet, men ikke i soma (+5,5 liter 1,5 versus -0,3 liter 1,1 mV, n=5, Mann–Hvidney, P<0,05; Fig. 4b). Depolarisationshastigheden blev også forstærket (fra 251 liter 59 til 289 liter 56 mV ms−1, n=5), og spidstærsklen blev hyperpolariseret (fra -35,7 liter 5,2 til -38,8 liter 4,3 mV, n=5). Vi konkluderer, at h-ADF i både CA3-og L5-pyramideceller er forbundet med stigningen i spidsamplituden målt i aksonet.

h-ADF er forbundet med forbedrede aksonale calciumsignaler

Vi brugte derefter Ca2+ billeddannelse til at bestemme konsekvensen af hyperpolariseringsinduceret forbedring af spidsamplitude i aksonet. CA3 pyramidale neuroner blev fyldt med 50 liter Aleksa-594; 250 liter Fluo-4 og spike-fremkaldte calciumsignaler blev målt i formodede en passant boutoner i afstande mellem 150 og 250 liter fra soma (Fig. 5a). Integralet af den spike-fremkaldte Ca2+ transient blev øget, når den presynaptiske spike blev fremkaldt efter en forbigående hyperpolarisering af kr20 mV (126 kr10%, n=5; Fig. 5b). Vi konkluderer, at presynaptisk hyperpolarisering under h-ADF forbedrer både presynaptisk spidsamplitude og spike-induceret Ca2+ tilstrømning, som efterfølgende forbedrer glutamatfrigivelse.

Nav-kanalinaktivering i aksonet bestemmer h-ADF

den øgede amplitude af den aksonale spids under hyperpolarisering kan skyldes genopretningen af Nav-kanaler fra inaktivering. For at bekræfte rollen som natriumkanalinaktivering i h-ADF brugte vi en NEURONMODEL af to monosynaptisk forbundne CA3-neuroner. Vi bestemte derefter forekomsten af modificerende inaktivering af natriumkanaler i aksonet på h-ADF. Når halvinaktiveringen af aksonale natriumkanaler blev indstillet til -80 mV (refs 18, 19), somatisk hyperpolarisering forbedrede spidsamplituden, ladningen af spidse-fremkaldt calciumstrøm og synaptisk transmission (Fig. 6a, venstre). Dette skyldes genoprettelsen af Nav-kanaler fra inaktivering ved hyperpolarisering (Fig. 6B, venstre). Imidlertid skete der ingen ændring, hvis halvinaktiveringen af de aksonale natriumkanaler blev indstillet til -70 mV (Fig. 6a, højre). I sidstnævnte tilfælde er andelen af tilgængelige Nav-kanaler allerede meget høj ved hvilemembranpotentiale, hvilket frembringer en AP med fuld amplitude (Fig. 6a, b, højre). Derfor påvirker genopretningen fra inaktivering ikke yderligere den presynaptiske spidsamplitude. H-ADF i modellen skyldes således genvindingen af Nav-kanaler fra inaktivering og forøges ved hyperpolarisering af Nav-halvinaktivering (Fig. 6c).

desuden brugte vi vores NEURONMODEL til at simulere aksonal nav-kanaltilgængelighed under en Theta-svingning svarende til den, der blev brugt i Fig. 2b. Nav-kanaler viste sig at inaktivere under depolarisering og genvinde under hyperpolarisering, hvilket forklarede EPSC-moduleringen under oscillationen (supplerende Fig. 4). Imidlertid er inaktivering hurtigere end genopretning under Svingningen på grund af den langsommere Nav-kinetik ved depolariserede potentialer (supplerende Fig. 4). Dette forklarer, hvorfor EPSC ‘ erne produceret ved 163 ms ikke frembragte nogen h-ADF, skønt spidsen udsendes fra et let hyperpolariseret potentiale (Fig. 2b). Faktisk havde Nav-kanalerne på dette tidspunkt af oscillationen ikke tid nok til at komme sig efter inaktivering (supplerende Fig. 4).

alt i alt understøtter disse resultater det faktum, at h-ADF skyldes genoprettelsen af Nav-kanaler fra inaktivering.

nav-kanaltæthed bestemmer styrken af h-ADF

h-ADF afhænger af tilgængeligheden af natriumkanaler i aksonet. Således bør reduktion af Nav-kanalernes tæthed påvirke h-ADF. Faktisk viste vores model, at reduktion af Nav-kanaltætheden til 70% af kontroltilstanden forbedrede h-ADF fra 130 til 180% (Fig. 7a). Den kritiske parameter her var gevinsten af presynaptisk spike overskridelse, der afhænger af aktiverbar Na konduktans (Fig. 7b). Under kontroltilstand var denne værdi allerede høj, og hyperpolarisering af det presynaptiske element fra -78 til -93 mV forbedrede spidsens amplitude med 28%. Når nav-tætheden blev reduceret, forbedrede den samme hyperpolarisering amplituden af den presynaptiske AP med 42%.

Vi verificerede derefter eksperimentelt, at reduktion af Nav-kanaltætheden øgede h-ADF i CA3-neuroner. Vi blokerede derfor delvist Nav-kanaler med en lav koncentration af tetrodotoksin (ttks) påført i badet (15-25 nM). 80 %af Na + strømmen, men bevarer induktion af hurtige Na+ spikes24, 25. I nærvær af TTK blev spidsamplituden i soma reduceret med 45 liter 4% (n=9), og synaptisk transmission ved CA3–CA3-forbindelser blev reduceret med 55 liter 8% (N=9; supplerende Fig. 5). Vigtigst er det, at reduktion af andelen af aktiverbare Nav-kanaler med 15-25 nM TTKS viste sig at forbedre h-ADF i høj grad i modne neuroner, der udtrykker ingen h-ADF (fra 103-3% i kontrol til 121-4% i nærvær af ttks, n=6, p<0,05; Fig. 7c, d). Disse data bekræfter derfor, at h-ADF i CA3-neuroner afhænger af tilgængeligheden af Nav-kanaler.

t-Type Ca2+ kanaler er til stede i aksonet. De kunne aktiveres under hyperpolariserings–depolarisationssekvensen, der blev brugt til at inducere h-ADF og kan således redegøre for h-ADF. Imidlertid viste det sig, at h-ADF forblev stabil i nærvær af 100 nM mibefradil, en T-type kanalblokker (fra 112,2 liter 1,1% i kontrol til 116,2 liter 11,9% med mibefradil, n=3; data ikke vist), hvilket antyder, at T-type Ca2+ kanaler ikke deltager i h-ADF.

h-ADF fremmer netværkssynkroni

Vi testede derefter implikationen af h-ADF i netværkssynkroni ved hjælp af en hippocampal netværksmodel dannet af 80 pyramidelignende ophidsende celler (e-celler) og 20 interneuronlignende hæmmende celler (i-celler) sammenkoblet (Fig. 8a; se metoder). E-og i-celler blev fodret med stokastisk input. Netværket af e-celler blev synkroniseret, og svingninger i gammaområdet optrådte som synaptisk styrke mellem e-celler steg (supplerende Fig. 6). Disse svingninger blev drevet af i-celler: aktivering af e-celler viste sig at fremme aktiveringen af i-celler, som igen tavede hele netværket (supplerende Fig. 6). Da h-ADF øger interpyramidal synaptisk styrke, når den presynaptiske spids indledes med en IPSP, er h-ADF en god kandidat til at fremme disse i-celle-drevne svingninger.

h-ADF-reglen blev inkorporeret i netværket ved at øge synaptisk styrke mellem e-celler i henhold til membranpotentialet målt 17 ms før spidsen. Faktisk blev synaptisk styrke øget med 20%, hvis det presynaptiske potentiale var under -84 mV (Fig. 8b). Denne regel blev direkte afledt af værdier målt eksperimentelt (se Fig 1a og 2a). For en e-celle-synaptisk styrke på 2,8 mS forbedrede tilføjelse af h-ADF i netværket markant både fyringsfrekvensen og synkroniseringen på tværs af e-celler (Fig. 8c-e). Faktisk blev tilbøjeligheden til at svinge i gammaområdet meget lettere, hvis h-ADF mellem e-celler var effektiv (Fig. 8e). Interessant nok forbedrede h-ADF-reglen i et netværk med shunting-hæmning (ECl=-73 mV i stedet for -80 mV i kontroltilstand) ikke synkronisering og fremmer ikke gamma-svingninger (supplerende Fig. 6). Da h-ADF imidlertid øger den synaptiske styrke mellem e-celler, kan dens synkroniseringseffekt simpelthen skyldes stigningen i netværkets spidshastighed. For at øge spidshastigheden uden at påvirke synaptisk styrke besluttede vi at fastsætte inter-e-cellestyrken ved 2,5 mS og øge den eksterne drevfrekvens for e-celler fra 6 til 20 hs. Vi planlagde synkroniseringskoefficienten i forhold til netværkets spidshastighed. Selvom synkronisering viste sig at være lineært korreleret med spidshastighed, øgede h-ADF synkroniseringskoefficienten for en given spidshastighed i 4-14-HS-området (supplerende Fig. 6). Dette viste, at for lav spidshastighed øger h-ADF synkroni uafhængigt af den gennemsnitlige netværksaktivitet. Afslutningsvis øger h-ADF i vores model netværkssynkronisering og fremmer oscillationer ved at forbinde interpyramidal synaptisk styrke med aktivitet af interneuroner.