1 Teori
oligonukleotider syntetiseres ved tilsætning af en base ad gangen, der strækker sig fra 3′ til 5′-enden, fastgjort til en fastfasestøtte. Når den kemiske syntese af oligonukleotidet er afsluttet, frigives DNA-kæden fra den faste understøtning ved inkubation med ammoniumhydroksid. Ammonium fungerer også som et afbeskyttende middel og spalter grupperne, der beskytter fosfaterne i phosphodiesterbindingerne. Efter dette tilsættes varm ammoniak for at hydrolysere de beskyttende grupper fra de eksocykliske aminogrupper af deoksyadenosin, deoksycytosin og deoksyguanosin. Oligonukleotidet kunne leveres til brugeren i ammoniakopløsningen som et råpræparat. I dette tilfælde kan det før brug være nødvendigt at udføre et yderligere trin for at fjerne salte og biprodukter fra oligonukleotidpræparatet genereret under afbeskyttelse.
efter afbeskyttelse afsaltes oligonukleotidpræparatet sædvanligvis, kvantificeres, fordampes til tørhed i en lyofilisator og leveres til brugeren i form af et pulver. Den afsaltede oligonukleotidopløsning indeholder oligonukleotid i fuld længde, men indeholder også en blanding af trunkerede produkter, der blev akkumuleret under den kemiske syntese. Trunkering opstår, når den angivne base ikke tilføjer til kæden i den tilsvarende cyklus (Hecker & Rill, 1998). Således bestemmes procentdelen af trunkerede produkter akkumuleret i præparatet ved synteseeffektiviteten (fraktionen af produkt i fuld længde efter syntese) og molekylets længde. Lange oligonukleotider, som kræver flere cyklusser, der skal syntetiseres, er mindre rene end korte oligonukleotider. Disse fejl kan konkurrere med produktet i fuld længde i nogle applikationer og kan være nødvendigt at fjerne, før oligonukleotidet kan bruges. Imidlertid er afsaltede oligonukleotidpræparater sædvanligvis egnede til mange anvendelser, såsom standard PCR eller mikroarrays, især hvis oligonukleotid er < 20 nukleotider i længden.
yderligere oprensning for oligonukleotider længere end 50 baser anbefales, fordi procentdelen af produkt i fuld længde i præparatet typisk ikke er højere end 80%. Til krævende anvendelser, hvor oligonukleotidets nøjagtige længde er vigtig, såsom gel-shift-assays, stedstyret mutagenese, sekventering, produktion af kloningsadaptere eller cDNA-syntese i første streng til generering af biblioteker, anbefales yderligere oprensning, selv for kortere oligonukleotider (se mere information om teknikkerne ovenfor om Standard in vitro-Assays for protein – Nukleinsyreinteraktioner-Gel shift-Assays for RNA og DNA-Binding og Stedstyret mutagenese).
oprensning kan være nødvendig efter syntese eller efter ensymatisk modifikation af oligonukleotidet. Der er flere metoder til at opnå dette, og valget afhænger af oligonukleotidets art og den anvendelse, den er beregnet til.
omvendt fase HPLC-oprensning er baseret på hydrofobicitet. Den bruger en ikke-polær stationær fase og vandige buffere og organiske opløsningsmidler som den mobile fase til at eluere analytterne; polære forbindelser elueres først, mens ikke-polære forbindelser bevares. Dette er den bedste metode til rensning af oligonukleotider modificeret med en hydrofob gruppe, såsom biotin, fluorescerende farvestofetiketter eller NHS-esterkonjugationer. Massegenvindingen er højere end ved anvendelse af sideoprensning, og den er modtagelig for oprensning af større mængder oligonukleotider (mmol skala), selvom den ikke fjerner ufuldstændige produkter så effektivt. Oligonukleotidrensningspatroner, der er baseret på omvendt fasekromatografi, tilvejebringer en hurtig metode til afsaltning og rensning af oligonukleotider.
Polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) løser oligonukleotider i henhold til deres længde og giver derved tilstrækkelig opløsning til at differentiere produkter i fuld længde fra mislykkede molekyler (Atkinson og Smith, 1984). Polyacrylamidgeler er mere effektive til at adskille små fragmenter af DNA end agarosegeler (se analyse af RNA ved analytisk polyacrylamidgelelektroforese og agarosegelelektroforese). Den eneste ulempe ved polyacrylamidgeler er, at de er sværere at forberede og håndtere end agarosegeler. Polyacrylamidgeler køres i en lodret konfiguration i et konstant elektrisk felt. Efter elektroforese elueres oligonukleotidet fra gelen og koncentreres ved anvendelse af ethanoludfældning (find mere om udfældning af nukleinsyrer på RNA – oprensnings-udfældningsmetoder) eller omvendt fase kromatografi. Dette er den valgte metode, når den højeste procentdel af oligonukleotider i fuld længde ønskes til krævende applikationer. Det anbefales også stærkt til oligonukleotider længere end 30 baser. Flere prøver kan også køres samtidigt, og der kræves ikke dyrt udstyr. Den eneste ulempe ved denne teknik er den lille mængde oligonukleotid opnået pr. Typisk anvendes oligonukleotider i en skala på 1 liter eller mindre, og massegenvindingen efter sideoprensning er < 50% og endnu lavere i tilfælde af modificerede oligonukleotider. Ikke desto mindre, selvom udbyttet er lavt, er det tilfredsstillende for de fleste biokemiske anvendelser.
oligonukleotidpræparatet lægges på en denaturerende polyacrylamidgel i en mængde på mindst 1 mg pr.bane. Gelens opløsning afhænger af koncentrationen af polyacrylamid. For korte oligonukleotider (fra 15 til 35 baser) anbefales 13-15% polyacrylamidgeler; for længere oligonukleotider (fra 35 til 70 baser) anbefales 8-13% polyacrylamidgeler. Procentdelen af gelen skal tilpasses løbesystemet. Vi bruger normalt Bio – Rad Mini Protean II-systemet og kører 15% geler til at rense oligonukleotider på 25 baser i længden. Efter identifikation af det korrekte bånd ved UV-visualisering udskæres båndet og ekstraheres fra gelen.
to forskellige metoder til rensning af oligonukleotider fra polyacrylamidgeler er beskrevet i dette kapitel. Den enkleste metode er eluering ved hjælp af diffusion. Dette er baseret på bevægelsen af molekyler fra en region med højere koncentration til en med en lavere koncentration. Resultatet af diffusion er en gradvis blanding af materiale. Denne metode er tidskrævende, men det kræver ikke for meget arbejde eller noget udstyr. Grundlæggende skæres polyacrylamidbåndet, der indeholder oligonukleotidet af interesse, i små stykker og dækkes med elueringsbuffer. Efter inkubation renses DNA ‘ et fra supernatanten ved ethanoludfældning. Udbyttet er begrænset mellem 20% og 70% afhængigt af længden af oligonukleotid. Jo større mængden af elueringsbuffer, der anvendes, jo mere oligonukleotid diffunderes fra gelen.
den anden metode er elektroelution i en dialysepose (McDonell et al., 1977). Gelstykket, der indeholder oligonukleotidet, udskæres og anbringes i en dialysepose med en buffer. Anvendelsen af en elektrisk strøm får DNA ‘ et til at migrere ud af gelen ind i dialyseposebufferen. Oligonukleotidet udvindes fra denne buffer og renses. Ved anvendelse af denne metode kan oligonukleotidet isoleres med et godt udbytte, skønt det er tidskrævende, hvis et stort antal prøver renses på samme tid, fordi det kræver indsættelse af hvert gelbånd i individuelle dialyseposer. Denne metode fungerer også godt til større DNA-fragmenter og kan endda bruges til at ekstrahere DNA fra agarosegeler.