Frontiers in Neuroscience

introduktion

i det nittende århundrede, karrus 80 år efter opdagelsen af lactat (La−) af Scheele (Kompanje et al., 2007), bemærkede Louis Pasteur, at fakultative gærceller voksede mere under aerobe end anaerobe forhold, men forbruget af sukker blev reduceret, og gæringen til alkohol var mindre under aerobe forhold (Pasteur, 1861). Tidligere havde Pasteur (1858) erkendt, at nogle typer gærgæret sukker til La− under anaerobe, men ikke aerobe forhold. Dette fænomen (for både alkohol og La− fermentering) er blevet kaldt Pasteur-effekten (Barnett and Entian, 2005). Et parallelt fænomen blev opdaget i skeletmuskulatur og hele dyr. For skeletmuskulatur Fletcher og Hopkins (1907) rapporterede, at La− påløbne i anaerobe frø muskler i hvile. Under stimulering steg La− koncentration () hurtigt i anaerob amfibisk muskel, men forsvandt, da disse trætte muskler fik lov til at komme sig i et ilt (O2) rigt miljø. Derefter demonstrerede Meyerhof endeligt, at glykogen var forløberen for La− in isolerede muskler, og den fulde glykolytiske vej blev belyst i begyndelsen af 1940 ‘ erne (Meyerhof, 1942; Brooks and Gladden, 2003). Den traditionelle dogme blev bygget på denne ramme og anden forskning om hypoksi: Pyruvat er slutproduktet af glykolyse under aerobe forhold, og La-er slutproduktet, når O2 er utilstrækkelig. Schurr (2006) diskuterede denne dogme fra synspunktet om hjernemetabolisme.

det er almindeligt accepteret, at intracellulære PO2-værdier på 0,5 Torr eller mindre resulterer i O2-begrænset oksidativ phosphorylering, en tilstand betegnet dysoksi (Connett et al., 1990), med efterfølgende La-produktion og akkumulering. Men Stainsby og Velch (1966) rapporterede La− udstrømning fra en tilsyneladende godt iltet kontraherende muskel. Derefter observerede J. Prisbsis og Stainsby (1968) La− produktion og frigivelse fra en kontraherende hundeskeletmuskel, mens nad+/NADH-parret blev mere iltet, en indikation af tilstrækkelig O2-forsyning. Ved hjælp af en anden tilgang, myoglobin cryomicrospectroscopy, at bestemme PO2 i hund gracilis muskel kontraherende ved gradvist hurtigere hastigheder, Connett et al. (1986) fandt stigende la− udstrømning uden tegn på dysoksi; De laveste PO2-værdier var generelt i størrelsesordenen 2 Torr. Richardson et al. (1998) brugte protonmagnetisk resonansspektroskopi (MRS) til at bestemme myoglobinmætning (og derved intracellulær PO2) hos mennesker under graderet træning. I parallelle eksperimenter med den samme type træning blev La− udstrømning bestemt via arteriovenøse koncentrationsforskelle og blodgennemstrømning. De fandt la-udstrømning i nærvær af intracellulære PO2-niveauer (~3 Torr), som ikke bør begrænse iltningsphosphorylering. V kurgga et al. (1998) rapporterede også, at isoleret, stimuleret nervevæv frigiver lactat under aerobe forhold.

disse fund sammen med andre rigelige omstændigheder tyder på, at netto La− produktion og udstrømning fra celler kan forekomme under aerobe forhold (Gladden,2004a, b). Faktisk foreslog Brooks (2000), at “lactat blev produceret hele tiden i fuldt iltede celler og væv.”Schurr (2006) diskuterede dette forslag i detaljer og foreslog, at “glykolyse altid fortsætter til sit sidste trin, LDH-reaktionen og dannelsen af lactat” i hjernevæv, men sandsynligvis også i mange andre væv. Efterfølgende leverede Schurr og Payne (2007) og Schurr og Gosal (2012) understøttende eksperimentelle beviser for dette postulat i hippocampale hjerneskiver. Her, vi omfavner dette koncept, foreslår, at selv i mangel af netto La− akkumulering, og i nærvær af rigelig O2, La− er det naturlige slutprodukt af glykolyse. Det er vigtigt, at vi bruger grundlæggende biokemiske principper til at underbygge dette koncept og genindføre Cytosol-til-mitokondrier lactat Shuttle.

LDH− reaktionen er en nær Ligevægtsreaktion

La−dannes i den følgende reaktion, der katalyseres af lactatdehydrogenase (LDH):

ligevægtskonstanten er stærkt til fordel for La−(1,62 L. 1011 M-1) (Lambeth og Lambeth) kushmerick, 2002), og LDH-aktiviteten er høj i forhold til de formodede regulatoriske ændringer i den glykolytiske vej i skeletmuskulatur (Connett and Sahlin, 2011), lever, nyre, hjertemuskel, milt og fedt (Shonk and bokser, 1964), hjerne (ivangoff et al., 1980; Morland et al., 2007), og både ondartede og godartede brysttumorer (Larner og Rutherford, 1978; Balinsky et al., 1984). Det er vigtigt, at LDH-aktiviteten også er høj i sammenligning med de formodede regulatoriske symptomer på pyruvatoksidering; se Spriet et al. (2000) til skeletmuskulatur, Morland et al. (2007) for hjernen, og Marie og Shinjo (2011) for hjernekræft. Mens målinger af vævs La – til pyruvatforhold er knappe, er nogle eksempelværdier kr.7:1 for leveren., 1985), 10-13:1 til hvile skeletmuskulatur (Sahlin et al., 1976; Pernille et al., 1985), og værdier så høje som 159:1 i skeletmuskulatur umiddelbart efter udtømmende dynamisk træning (Sahlin et al., 1976). Referenceværdier for La – til pyruvatforholdet i hjernen ved hjælp af mikrodialyseprober, gennemsnit 23:1 (Reinstrup et al., 2000; Sachsen et al., 2014). Typisk stiger forholdet efter traumatisk hjerneskade, selv i fravær af iskæmi eller PO2 med lavt væv(25)., 2014); L. 40 (Vespa et al., 2005)}. På trods af standardisering af teknikker afspejler mikrodialyseværdier ikke nødvendigvis reelle vævskoncentrationer., 2014). Ikke desto mindre er disse La− til pyruvat mikrodialyseværdier for menneskelig hjerne ikke langt væk fra værdier (l.13:1) opnået på rottehjernehomogenater (Ponten et al., 1973). Samlet set forstærker den høje i forhold til selv med tilstrækkelig O2− forsyning LDH-aktivitetens rolle i bestemmelsen af La-udseende. Den høje LDH− aktivitet og La-lænende ligevægtskonstant af LDH-reaktionen er nøgleelementer i påstanden om, at La-er det vigtigste slutprodukt af glykolyse under stort set alle metaboliske tilstande. Kort sagt, når som helst glykolyse er operativ, uanset lokal iltspænding, La− dannes i de fleste typer væv. Imidlertid kan mængden af La-produceret og faktisk akkumuleret (dvs.en forøget ) ændres af faktorer som O2-spænding, metabolisk hastighed, tilgængelig mitokondriel aktivitet og andre faktorer.

skæbne af pyruvat

potentielle skæbne af pyruvat er anført nedenfor. Vi foreslår, at ingen af disse processer forekommer med en hastighed, der matcher den indledende omdannelse af pyruvat til La−, hvilket sikrer, at La− altid er slutproduktet af glykolyse.

1. Udstrømning fra cellen primært via monocarboksylat transportører (MCT ‘ er). Imidlertid er La – altid til stede i en højere koncentration end pyruvat og vil afvige celler i en hurtigere hastighed end vil pyruvat.

2. Omdannelse til alanin via nær ligevægt alaninaminotransferase reaktion, som har en ligevægtskonstant på omkring 1 (Tiidus et al., 2012), så alaninkoncentration bør tilnærmes pyruvatkoncentration, og omdannelsen af pyruvat til alanin bør ikke forringe omdannelsen af pyruvat til La−.

3. Glukoneogene / Glykoneogene reaktioner. I glukoneogene væv kan pyruvat omdannes til oksaloacetat i en reaktion katalyseret af pyruvatcarboksylase (Pascoe and Gladden, 1996). I skeletmuskelglykoneogenese kan pyruvat omdannes til malat med katalyse ved æblesyre (Pascoe og Gladden, 1996) eller mere sandsynligt at phosphoenolpyruvat via reversering af pyruvatkinasereaktionen (Donovan og Pagliassotti, 2000). Disse reaktioner repræsenterer” reversering ” af glykolyse, og de begynder med La−, det naturlige slutprodukt af glykolyse. I hjernen er glykogen mest udbredt i astrocytter og sparsom til ubetydelig i neuroner. Selvom pyruvat er udtrykt i dyrkede astrogliale celler, oligodendrocytter, mikrogliale celler og ependymocytter (Murin et al., 2009), er vi uvidende om nogen information om evnen hos nogen af disse celler til at syntetisere glykogen fra La−.

4. Transport over mitokondriens indre membran med efterfølgende omdannelse til Acetyl-CoA via pyruvatdehydrogenase (PDH) – reaktionen efterfulgt af indtræden i tricarbonsyrecyklussen og iltning. Pyruvat krydser den indre mitokondrie membran via simpel diffusion og lettet diffusion; transportørerne er en MCT (Hashimoto et al., 2006) og den mitokondrie pyruvatbærer (Divakaruni og Murphy, 2012). Til løbende iltning af pyruvat er NADH-pendulkørsel i mitokondriematricen ved hjælp af malat-aspartat-og glycerolphosphat-pendulkørsler lige så vigtig som pyruvattransport.

den konstante tilstedeværelse af La− og dens ophobning i perioder med glykolytisk stimulering er tegn på, at LDH-reaktionen dominerer over disse alternative skæbne af pyruvat.

Figur 1 illustrerer en model af intracellulær metabolisme, som vi kalder “Cytosol-til-mitokondrier lactat Shuttle”; dens oprindelse kan spores til en gennemgang af La− metabolisme af Stainsby og Brooks (1990). På grund af den høje LDH− aktivitet og en ligevægtskonstant langt i retning af La−, La-er altid det overvejende resultat af glykolyse. Men dannelsen af La-er ikke synonymt med La− akkumulering og øget . Mitokondrier udgør en vask for pyruvat og under betingelser med langsom glykolytisk aktivitet med rigelig O2, iltning i de fleste celler er tilstrækkelig til nøje at matche produktionen ved glykolyse; transmembran la− strømning vil variere mellem langsom frigivelse og langsom optagelse, hvor frigivelse er den mere typiske tilstand. På en måde analog med kreatinkinase og phosphocreatin Shuttle, LDH holder pyruvat og La− in ligevægt i hele cellen cytosol. I dette scenario er La-den primære art, der rejser til kvarteret af mitokondrie retikulum, mest sandsynligt til intermembranrummet, hvor LDH er fastgjort til ydersiden af den indre mitokondrie membran (Hashimoto et al., 2006; Gladden, 2008). Her omdannes La− til pyruvat til indtræden i mitokondrier, givet den relative “vask” for pyruvat. Samtidig regenereres NADH fra reverseringen af LDH-reaktionen, og dets par elektroner sendes over den indre mitokondriemembran af malat-aspartat-og glycerolphosphatfærger. En vigtig forskel fra phosphocreatin Shuttle er, at to nøglekomponenter, La− og pyruvat, i modsætning til phosphocreatin, kan krydse plasmamembranen og forlade cellen.

Cytosol-til-mitokondrier− paradigmet hævder, at La− altid dannes under glykolyse, selvom La-ikke akkumuleres og er stabil. Selvfølgelig, hvis O2 er så lav, at oksidativ phosphorylering hæmmes, Vil La− produktionen overstige den hastighed, hvormed oksidativ metabolisme kan bruge pyruvat og NADH, hvilket får og La− udstrømning til at stige. Hvis glykolytisk aktivitet stiger selv med rigelige O2-niveauer, som i skeletmuskulatur, der trækker sig sammen med en moderat intensitet eller måske i aktiverede astrocytter (Pellerin og Magistretti, 2011), vil La− produktion ikke blive matchet af pyruvatoksidering og vil stige, ligesom transport af La− ud af cellen. Hvis der er en stigning i mitokondriefunktionen, vil der være en løbende uoverensstemmelse mellem La− produktion og efterfølgende pyruvat og NADH− iltning, hvilket resulterer i forhøjet og La-udstrømning. Denne sidstnævnte situation observeres i” Varburg ” kræftceller (Semensa, 2008) og hos KOL-patienter under træning i hele kroppen in vivo (Maltais et al., 1996).

med udholdenhedstræning øges skeletmuskulatur mitokondrielt indhold (Hollos og Coyle, 1984), og der er nu en større vask til pyruvat. ADP) for en bestemt iltningshastighed; disse samme stimuli er allosteriske stimulatorer af vigtige glykolytiske stoffer, så glykolyse reduceres. Derudover, hvis La− membrantransport hæmmes, især i celler, der allerede har en mismatch, hvor glykolyse foretrækkes frem for oksidativ metabolisme, er det sandsynligt, at cellulær vil stige med potentielt skadelige virkninger på cellen (Le Floch et al., 2011). Yderligere bør stærk inhibering af total LDH− aktivitet i glykolytiske celler forhindre ligevægt og derved reducere La-produktion, akkumulering og udstrømning (Fantin et al., 2006). Effekten af at ændre LDH-isosymmønsteret uafhængigt af inhibering eller reduktion af total LDH-aktivitet er dog endnu ikke fuldt ud løst., 2006).

fremtidige retninger: indflydelse af LDH-Isoform og applikationer til Tumormetabolisme

hvilken indvirkning har LDH-isoform, og hvordan kan denne viden anvendes til behandling af sygdomme med ændret metabolisme, som kræft?for det første er LDH et tetramer sammensat af to proteinunderenheder, som i alt er ca.135 kDa (Cahn et al., 1962). Tetramer kan samles som fem separate isosymer ved at danne alle kombinationer af M (muskel) form (produkt af Ldh-a gen) eller H (hjerte) form (produkt af Ldh-B gen) producerer: M4 (= A4 = LDH5), M3H1 (= A3B1 = LDH4), M2H2 (= A2B2 = LDH3), M1H3 (= A1B3 = LDH2) og H4 (= B4 = LDH1). Resultater fra undersøgelser in vitro indikerer forskellige kinetiske egenskaber med hensyn til substrataffinitet og inhibering blandt disse isosymer. De m-dominerede isosymer har 3,5 – 7 gange højere Km-værdier for pyruvat og La− end de h-dominerede former. Endvidere hæmmes H4-typerne af pyruvat i koncentrationer over ~0,2 mM, mens M4-typerne er lidt påvirket af pyruvatkoncentrationer så høje som 5 mM (Plagemann et al., 1960; Stambaugh og Post, 1966; Grunnet, 2011b). H4-isosymet hæmmes af over 20-40 mM, mens M4-isosymet er mindre hæmmet af høj (Stambaugh og Post, 1966). Disse punkter er blevet tilbudt som bevis for funktionelle forskelle i cellulær metabolisme af forskellige væv med hjerteformerne, der fremmer iltning, mens muskelformerne letter dannelsen af La− (Cahn et al., 1962). LDH-isosymfordelingen, der findes i naturen, passer til disse egenskaber bestemt in vitro. For eksempel har hurtigtrækning, glykolytisk, type II skeletmuskelfibre en større andel af M-type LDH-isosym, mens langsom trækning, iltning, type i-skeletmuskler såvel som hjertemuskel har en større andel af H-typen LDH-isosym (Van Hall, 2000). Kongruent reducerer udholdenhedstræning andelen af M-type LDH-isosym i de trænede muskler (Van Hall, 2000). I hjernen har astrocytter (som postuleres til at have en højere glykolytisk metabolisme) en større andel af M-typen LDH-isosym, mens neuroner (som hævdes at have en højere iltning metabolisme) har en større andel af H-typen LDH-isosym (Schurr, 2006; Pellerin og Magistretti, 2011). I tumorer har glycolytiske” Varburg-type ” – celler en større andel af M-type LDH-isosym, mens flere oksidative kræftceller har en større andel af H-type LDH-isosym (Semena, 2008). Så det omstændige bevis for LDH-isosymfordelingsmønstre falder sammen med den opfattede funktion af LDH-isosymerne som bestemt in vitro.

de ovennævnte beviser har ført til den konklusion, at LDH− isosymmønster er en årsagsfaktor i La-metabolisme. For yderligere at belyse rollen som LDH− isosymfordeling som koordinator for La-metabolisme, Summermatter et al. (2013) foretog en undersøgelse for at teste rollen som peroksisom proliferator-aktiveret receptor-kur-coactivator 1-Purpur (PGC-1-Purpur) som regulator for LDH-undertype-ekspression. PGC-1 er kendt for at være vigtig i koordineringen af cellulær energimetabolisme (vu et al., 1999). Som reaktion på en række forskellige stimuli stimulerer PGC-1-LH mitokondrial biogenese, fremmer overgangen af skeletmuskulatur til en mere oksidativ fænotype og bidrager til ændret kulhydrat-og lipidmetabolisme (Liang og Afdeling, 2006).

Summermatter et al. (2013) studerede muskel-specifikke PGC-1-transgene mus, såvel som muskel-specifikke PGC-1-mus, og fandt (1) lavere blod hos de transgene dyr og højere blod hos knockout-dyrene som reaktion på udholdenhedsøvelse, og (2) reduceret ekspression af M-type LDH hos de transgene dyr og reduceret H-type LDH hos knockout-dyrene. Disse forfattere konkluderede, som deres titel hævder, at ” skeletmuskulatur PGC-1 larr kontrollerer hele kroppen La− homeostase gennem østrogenrelateret receptor-relursafhængig aktivering af LDH B og undertrykkelse af LDH A.”Efter deres opfattelse er LDH−mønsteret en vigtig aktør i hele kroppens metabolisme af La -.

der er dog under-værdsatte formaninger vedrørende LDH-isosymfunktioner og deres potentielle roller i stofskiftet. For det første blev de førnævnte kinetiske egenskaber for LDH-isoformer bestemt in vitro ved 20 eller 25 liter C, og Km-værdierne for pyruvat stiger med temperaturen, omtrent fordoblet ved 37 liter C sammenlignet med 25 liter C (Latner et al., 1966; Grunnet, 2011b). Tidligere har Nyholme og Leech (1983), Van Hall (2000), Nyholme (2004), Gladden (2008) og Grunnet (2011a) rejst væsentlige spørgsmål om LDH− isosymprofilernes rolle i La-produktion vs. udnyttelse, idet man bemærker, at: (1) ikke ændrer ligevægtskonstanten for en reaktion; (2) LDH-reaktionen er nær ligevægt, hvilket minimerer allosteriske effekter; (3) forskelle i en reaktion er en funktion in vivo er muligvis ret lille på grund af de højere fysiologiske temperaturer og binding til strukturer eller andre proteiner; (4) de koncentrationer af La− og pyruvat, der er nødvendige til LDH-hæmning in vitro, er meget højere end de højeste koncentrationer, der observeres in vivo; og (5) LDH-hæmning in vitro kan skyldes spor af enolformen af pyruvat, der er mindre tilbøjelige til at være til stede in vivo.

selvom Summermatter et al. (2013) stat med overbevisning om, at LDH isoform mønster er en vigtig faktor i hele kroppen La− metabolisme, der er en dødelig fejl i deres design. De ignorerede det faktum, at PGC-1-transgene mus har øget mitokondriel proliferation og oksidativ phosphorylering, hvorimod PGC-1-mus med PGC-1-knockout har signifikante reduktioner i cytokrom-og citratsyntaseaktiviteter (Arany et al., 2005). Efter vores mening, disse ændringer i mitokondriefunktion, den tidligere bemærkede høje totale LDH-aktivitet uanset isosymmønster, og den nærmeste ligevægtskarakter af denne reaktion gør konklusionerne fra Summermatter et al. (2013) uholdbar. Derfor konkluderer vi, at de nøjagtige fysiologiske og biokemiske roller af LDH-isosymer in vivo fortsat skal afklares endeligt.

endelig med hensyn til tumormetabolisme er forståelsen af, at La− er slutproduktet af glykolyse, afgørende for at designe interventioner til målretning af kræft. Kort fortalt eksperimenter af Cori og Cori (1925) og af Varburg et al. (1927) viste, at tumorer syntes at være ivrig forbrugende glukose og producere La−. Efterfølgende dogme i tumormetabolisme har fastslået, at tumorer udviser en “Varburg−effekt”, der producerer og eksporterer La -. Men vi ved nu, at ikke kun forskellige tumortyper håndterer La-forskelligt (nogle er nettoproducenter, nogle er netforbrugere), men selv inden for en enkelt tumor kan der være shuttling mellem forskellige celletyper; en celle til celle La− shuttle (Semena, 2008). Mange kræftceller er fattige forbrugere af lactat., 2008) gnister spekulationer om, at a La-beskyttet hypoglykæmi kan være terapeutisk (Nijsten og van Dam, 2009). I modsætning hertil bruger nogle tumorer ivrigt La – som brændstof og reagerer på supplerende La− med øget proliferation og vaskularisering, sandsynligvis et direkte resultat af opregulering af vaskulær ENDOTELVÆKSTFAKTOR (VEGF) og hypoksi-inducerbar faktor 1-liter (HIF-1-liter). I en nylig undersøgelse af en dyremodel af en sarkom, Goodvin et al. (2014) rapporterede, at La− kørte sarkomagenese i fravær af hypoksi. Utroligt nok forbliver vores forståelse af La-metabolisme i kræft urolig næsten 90 år efter Varburgs første undersøgelser.

konklusioner

vores forståelse af La− formation har ændret sig drastisk siden dens opdagelse. Traditionelt er pyruvat blevet anset for at være slutproduktet af glykolyse, når O2 er til stede, og La− slutproduktet i perioder med dysoksi. I slutningen af det tyvende århundrede og det tidlige enogtyvende århundrede blev det opdaget, at O2 ikke begrænser til oksidativ phosphorylering under de fleste cellulære forhold, og La-produceres faktisk, selv når der ikke er nogen begrænsning på hastigheden af O2− levering til mitokondrier. Yderligere refleksion over aktiviteten af LDH og ligevægtskonstanten for dens reaktion fremmer antagelsen om, at La− er det primære slutprodukt af glykolyse under de fleste, hvis ikke alle metaboliske tilstande i de fleste celler. De forskellige LDH-isosymers rolle i stofskiftet er ikke så tydeligt som de fleste forskere antyder, og vi konkluderer, at deres nøjagtige funktion forbliver uopdaget. Hvorvidt vi er korrekte om Cytosol-til-mitokondrier lactat Shuttle som beskrevet her og den usikre rolle LDH isoformer vil være vanskeligt at evaluere under betingelser in vivo. En tilgang er modellering i silico. Forståelse af de nøjagtige mekanismer for glykolyse og La-metabolisme vil ikke kun uddybe vores forståelse af metabolisme i sunde væv, men vil også give indsigt i syge eller skadede væv, hvor de mest oplagte anvendelser er den forstyrrede kulhydratmetabolisme, der findes i kræftceller (Vander Heiden et al., 2009) og cerebral metabolisme efter traumatisk hjerneskade (Brooks og Martin, 2014).

interessekonflikt Erklæring

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.