V pořadí, jak využít sílu cílené navádění endonucleases, Jerome laboratoři pracoval na optimalizaci užitečná dodávka systému pro in vivo a in vitro studií. Použili například adeno-asociovaný virus (AAV) dodání systému na cílové myši trojklaných uzlin s jedním ze dvou HSV konkrétní endonucleases: HSV1m5, který je navržen tak, aby štěpit virion bílkovin VP5 genu, a HS1m8 ,který se zaměřuje gen kódující DNA polymeráza katalytické podjednotky. Vytváření mutací v jednom z těchto genů způsobuje narušení virového genomu a zabraňuje produkci virionů. V zájmu dalšího zvýšení účinků léčby Trex-2, 3′-5′ endonukleázy, které bylo prokázáno, že zvýšení directed mutageneze, byl co-transduced. Po zavedení systému začala laboratoř in vitro pracovat se zaměřením na neurony, biologicky relevantní typ buňky. Kultury neuronů byly souběžně transdukovány s HSV1m5 nebo 8 a Trex-2 a poté infikovány HSV. Ošetřených kulturách ukázaly 50% snížení virového titru stejně jako přítomnost mutací v HSV do T7 Endonukleázy 1 testu a klonální sekvenování. Jakmile bylo zjištěno narušení lytické infekce, vědci začali zkoumat účinky na různá stadia infekce HSV. Použitím infikovaných kultur neuronů s HSV a následným ošetřením HSV1m5 nebo 8 Trex-2 v různých časových bodech mohli vědci simulovat různá stadia infekce. Zacházeli kultur na 7 dní (akutní fáze), 14 dnů (pozdní akutní/ časné latentní fáze), a 32 dní (latentní fáze), a zjistil, žádná změna účinku bez ohledu na virovou fázi. To naznačuje, že HSV je podobně citlivý na endonukleázy mutageneze bez ohledu na virovou fázi. Hladiny mutací v cílovém místě se pohybovaly v rozmezí 4,5-7,6% u HSV1m5 a 1,1-6,6% u HSV1m8. V současné době se jedná o první studii zaměřenou na aktivitu endonukleázy v latentně infikovaných neuronech.
podpořen výsledky in vitro, vědci se provádí in vivo studiích na myších infikovaných HSV následoval 32 dní později AAV (vyjádření HSV1m5 nebo 8 a Trex-2) injekce. Neurony z myší byly odebrány 30 dní po injekci AAV pro virové titry, virovou zátěž a mutace genomu HSV. Skupina vykazovala 1-2% mutace u 2/4 myší pro HSV1m5 a u 3/4 myší pro HSV1m8. Virová nálož těchto zvířat však byla mezi kontrolními a léčenými zvířaty podobná. Vylučování viru bylo u léčených zvířat zpožděno o jeden den, ale v průběhu času dosáhlo podobných úrovní ve srovnání s neléčenými. Na odráží na výsledcích Dr. Jerome řekl, „Toto je poprvé, kdy skutečné latentní virová infekce byla založena v zvíře, a pak se vypne, a to i částečně, pomocí endonukleázy terapie. Představuje tedy kritický krok k tomu, aby takové terapie byly aplikovány na člověka. Hlavním úkolem je nyní zvýšit účinnost terapie tak, aby byl celý nebo téměř celý latentní virus geneticky deaktivován. Vyšetřujeme novější, účinnější nukleázami jako CRISPR/Cas, a hodnocení nových metod přináší nukleázami na infikovaných neuronů in vivo.“V budoucnu může tato terapie vést k novému způsobu myšlení o léčbě latentních onemocnění, jako je HSV a HIV, které v současné době považujeme za nevyléčitelné.
financování tohoto výzkumu poskytly Národní instituty zdraví a kanadská nadace.
Aubert M,EA Madden,Loprieno M,Starém Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret,Galleto R,Kámen D,Jerome KR. 2016. In vivo narušení latentního HSV designérskou endonukleázovou terapií. JCI Insight, 1 (14).