| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein konstrukce: | Pfam | PDB | PDBsum | |||
Taq PolA má celkovou strukturou podobné E. coli PolA. Střední 3′ -5 ‚ exonukleázová doména zodpovědná za korekturu byla dramaticky změněna a není funkční. Má funkční 5‘ -3 ‚ exonukleázovou doménu na amino terminálu, popsanou níže. Zbývající dvě domény působí koordinovaně, prostřednictvím spřaženého pohybu domény.
Exonukleáza domainEdit
Taq polymeráza exonukleáza je doména nacházející se v amino-terminálu Taq DNA polymerázy I (termostabilní). Předpokládá ribonukleázový motiv podobný h. Doména propůjčuje polymerázě 5′ -3 ‚ exonukleázovou aktivitu.
na Rozdíl od stejné domény v E. coli, které by mohly zhoršit primery a musí být odstraněny tím, že trávení pro PCR používat, tato doména není řekl k degradaci nátěru. Tato aktivita se používá v taqmanově sondě: jako dcera prameny jsou tvořeny, sondy komplementární k šabloně přijít do styku s polymerázy a je štěpen na fluorescenční kousky.
vazba s Dnaeditem
Taq polymeráza je vázána na rozštěpu polymerázového aktivního místa s tupým koncem duplexní DNA. Jako Taq polymerázy je v kontaktu s navázanými DNA, jeho strana řetězce tvoří vodíkové vazby s purinů a pyrimidinů v DNA. Stejná oblast Taq polymerázy, která se navázala na DNA, se také váže s exonukleázou. Tyto struktury navázané na Taq polymerázu mají různé interakce.
MutantsEdit
site-directed mutageneze experiment, který zlepšuje vestigal 3′-5′ exonuclease činnost o faktor 2 byl hlášen, ale nikdy to nebylo oznámeno, zda se tak snižuje chybovost. Po podobné linii myšlení, chiméra proteinů byly provedeny pomocí cherry-picking domén z E. coli, Taq, a T. neopolitana polymerázy I. Vymění vestigal domény pro funkční jeden z E. coli vytvořil protein s proof-schopnost čtení, ale nižší optimální teploty a nízká termostabilita.
byly vytvořeny verze polymerázy bez 5′ -3 ‚ exonukleázové domény, mezi nimiž jsou nejznámější Klentaq nebo stoffelův fragment. Úplný nedostatek aktivity exonukleázy činí tyto varianty vhodnými pro primery, které vykazují sekundární strukturu, stejně jako pro kopírování kruhových molekul. Jiné variace zahrnují použití Klentaq s high-fidelity polymeráza, Thermosequenase, že uznává, substráty, jako T7 DNA polymerázy, mutanti s vyšší tolerance k inhibitorům, nebo „domény-označené“ verze, které mají navíc helix-hairpin-helix motiv kolem katalytického místa držet DNA více pevně i přes nepříznivé podmínky.
Význam v nemoci detectionEdit
z Důvodu zlepšení Taq polymerázy dispozici v PCR DNA replikace: vyšší specificita, méně nespecifických produktů a jednodušší procesy a Vybavení, to bylo nápomocné v úsilí o detekci nemocí. „Použití Polymerázové Řetězové Reakce (PCR) v infekční onemocnění, diagnóza, má za následek schopnost diagnostikovat brzy a náležitě léčit onemocnění vzhledem k náročné patogeny, stanovení antimikrobiální citlivosti na pomalu rostoucí organismy, a zjistit kvantové infekce.“Implementace Taq polymerázy zachránila nespočet životů. Sloužil důležitou roli v detekci mnoha světových nejhorších chorob, včetně tuberkulózy, streptokokové faryngitidy, atypický zápal plic, AIDS, spalničky, hepatitida, ulcerózní urogenitální infekce. PCR metoda používá k znovu vytvořit kopií DNA specifických vzorků, umožňuje detekci onemocnění je to možné tím, že cílení na specifické DNA sekvence cílových patogenů z pacienta vzorku a zesilování stopové množství orientačních sekvencí zkopírováním až miliardkrát. I když se jedná o nejpřesnější metodu detekce onemocnění, zejména u HIV, není prováděna tak často jako alternativní, horší testy kvůli relativně vysokým nákladům, práci a potřebnému času.
spoléhání se na Taq polymerázu jako katalyzátor pro proces replikace PCR bylo zdůrazněno během pandemie COVID-19 v roce 2020. Nedostatek nezbytného enzymu narušil schopnost zemí na celém světě vyrábět testovací soupravy na virus. Bez Taq polymerázy je proces detekce onemocnění mnohem pomalejší a zdlouhavý.
navzdory výhodám použití Taq polymerázy při detekci onemocnění PCR není enzym bez jeho nedostatků. Retrovirové nemoci: HIV, HTLV-1 a HTLV-II; často zahrnují mutace z guaninu na adenin v jejich genomu. Mutace, jako jsou tyto, jsou to, co umožňuje testy PCR k detekci onemocnění, ale Taq polymerázy je relativně nízká míra fidelity je stejné G-k-mutace se vyskytují a případně výnos falešně pozitivní výsledek testu.