POKUS
Jak je uvedeno v řešení problémů test v minulém čísle Biochemie a Molekulární Biologie Vzdělávání , transkripční jednotka, kódující enzymy biosyntézy tryptofanu je regulována trp1 repressor: tryptofan působí jako corepressor se váže na a aktivuje repressor, což se váže na operátor regionu a blokuje pohyb RNA-polymerázy, a to znamená, že transkripce strukturní geny trp E, D, C, B, a kódující enzymy pro syntézu tryptofanu. Nicméně, tato inhibice je „děravý“: tam je nějaký přepis operon i v přítomnosti tryptofanu; to by plýtvat energií pro výrobu enzymů, které nejsou potřeba. Druhý regulační mechanismus, nazývaný útlum, srazí tuto zbytkovou transkripci na operonu trp .
krátká oblast mezi operátorem a prvním strukturálním genem (trp E), nazývaným leader (obr. 1), je zodpovědný za útlum. Leader sekvence je ∼140 basepairs dlouhé a kódy pro 5 ‚ – end oblast trp mRNA předcházející iniciační kodon prvního strukturálního genu. Leader region TRP mRNA má jedinečnou strukturu (obr. 2a). Obsahuje krátký otevřený čtecí rámec (ORF) kódující oligopeptid zvaný leader peptid. Dvě palindromické sekvence (oblast 1/2 a oblast 3/4) produkují samokomplementární basepairing, který vede k tvorbě vlásenkových struktur. Druhá vlásenka (oblast 3/4) je následována úsekem Us, což vytváří strukturální charakteristiku určitých transkripčních terminátorů. Kódování ORF pro leader peptid se překrývá s oblastí 1 a obsahuje dva kodony pro tryptofan. Kromě toho se regiony 2 a 3 doplňují nejen s regiony 1 a 4, ale také navzájem. Tato poměrně komplikovaná struktura sekvence leader připravuje půdu pro důmyslný mechanismus regulace transkripce operonu.
Obr. 1. Struktura tryptofanového operonu E. coli.(P, promotor; o, operátor; L, vůdce; E, D, C, B A a, strukturální geny. Obrázek není nakreslen v měřítku: oblasti P, O A L jsou mnohem kratší než geny kódující proteiny.)
Obr. 2. Útlum v regulaci TRP operonu E. coli. a) struktura 5 ‚ koncové oblasti TRP mRNA. b) uvolnění útlumu v prostředí s nízkým obsahem tryptofanu. (c) předčasné ukončení (útlum) transkriptu trp ve vysoce tryptofanovém médiu(podrobnosti viz text).
Útlum je založen na spolu přepis/překlad u prokaryot: ribozomy se váží na rodící se mRNAs tvořící chromozom–polysome komplexy; to znamená, syntézu bílkovin začíná v rostoucí mRNA řetězce. Pokud tryptofan není k dispozici (obr. 2b), ribozom stání v leader peptid kódující ORFs narušuje vlásenku 1/2 a vede k tvorbě vlásenky 2/3. Tato vlásenka zabraňuje vzniku ukončení vlásenka 3/4 (tzv. atenuátor), a, tudíž, RNA polymeráza je schopna pokračovat v prodloužení a přepíše celý operon do celovečerní přepis. Pokud je však přítomen tryptofan, ribozom se stále pohybuje a zabraňuje tvorbě vlásenky 1/2 a 2/3 (obr. 2c). Atenuátor vlásenka 3/4 může tvořit a ukončí transkripci. Peptid leader a krátká RNA leader jsou pak rychle degradovány a strukturální geny nejsou transkribovány. Zkontrolujte mechanismus a vyřešte následující test.
V této fiktivní experiment dva trp operon mutanti jsou použity: v jedné z nich dva UGG kodony kódující tryptofan byly převedeny na GGGs (kodony pro glycin; označené jako „trp kodony mutant“ v průběhu zkoušky), v druhém, v regionu 3 byla odstraněna („region 3 mutant“).
Divoký Typ E. coli buňky, „TRP kodonové mutanty“ a „region 3 mutanty“ jsou kultivovány v bohatém médiu obsahujícím všechny aminokyseliny (včetně tryptofanu) v optimálních koncentracích. Co se s nimi stane?
analýza experimentu
- (a)
Pokud je prohlášení podporováno poskytnutými informacemi;
- (b)
Pokud je prohlášení v rozporu s uvedenými informacemi;
- (c)
pokud prohlášení není poskytnutými informacemi podporováno ani v rozporu.
- 1)
____ „TRP codon mutant“ buňky umírají.
- 2)
_ _ _ _ _ buňky divokého typu rostou nejrychleji.
- 3)
____ „Region 3 mutantní“ buňky rostou nejpomaleji za takových podmínek.
- 4)
_ _ _ _ _ chromozom–polysomové komplexy se tvoří na operonu trp ve všech třech buňkách.
- 5)
_ _ _ _ _ tryptofan je syntetizován ve významných množstvích pouze v buňkách“ region 3 mutant“.
- 6)
_____ Pomocí trp vůdce fragment DNA jako sondu, Northern blot analýzy buněčné RNA v „trp kodony mutanti“ identifikuje silné pásmo, které odpovídá 140‐nukleotidů RNA.
- 7)
_ _ _ _ _ pomocí stejné sondy je ve vzorcích buněčné RNA divokého typu detekováno velké množství transkriptů operonu trp v plné délce.
stejné buňky se nyní pěstují v médiu obsahujícím všechny aminokyseliny kromě tryptofanu. Jak se buňky chovají za takových podmínek?
analýza experimentu
- (a)
v případě, že prohlášení je podporován informace;
- (b)
v případě, že prohlášení je v rozporu se uvedené informace;
- (c)
v případě, že prohlášení je podporováno ani vyvráceno informace.
- 8)
____ „TRP codon mutant“ buňky umírají.
- 9)
_ _ _ _ _ buňky divokého typu rostou nejrychleji.
- 10)
____ „Region 3 mutantní“ buňky rostou nejpomaleji za takových podmínek.
- 11)
_ _ _ _ _ chromozom–polysomové komplexy se tvoří na operonu trp ve všech třech buňkách.
- 12)
_ _ _ _ tryptofan je syntetizován ve významných množstvích pouze v buňkách“ region 3 mutant“.
- 13)
_____ Pomocí trp vůdce fragment DNA jako sondu, Northern blot analýzy buněčné RNA v „trp kodony mutanti“ identifikuje silné pásmo, které odpovídá 140‐nukleotidů RNA.
- 14)
_ _ _ _ _ pomocí stejné sondy je ve vzorcích buněčné RNA divokého typu detekováno velké množství transkriptů operonu trp v plné délce.