1 Teorie
Oligonukleotidy jsou syntetizovány přidáním jedné základny na dobu, sahající od 3′ k 5′-konci, které jsou připojeny k pevné fázi podpory. Po dokončení chemické syntézy oligonukleotidu se řetězec DNA uvolní z pevné podpory inkubací s hydroxidem amonným. Amonium také působí jako deprotektivní činidlo a štěpí skupiny chránící fosfáty ve fosfodiesterových vazbách. Poté se přidá horký amoniak k hydrolýze ochranných skupin z exocyklických aminoskupin deoxyadenosinu, deoxycytosinu a deoxyguanosinu. Oligonukleotid by mohl být dodán uživateli v roztoku amoniaku jako surový přípravek. V tomto případě může být před použitím nutné provést další krok k odstranění solí a vedlejších produktů z oligonukleotidového přípravku generovaného během deprotekce.
Po deprotection, oligonukleotid příprava je obvykle odsolený, kvantifikovat, odpaří se do sucha na lyofilizační přístroj, a dodává uživateli ve formě prášku. V odsolené oligonukleotid roztok obsahuje full-délka oligonukleotid, ale také obsahuje směs z redukovaných produktů, které byly nahromaděné během chemické syntézy. Zkrácení nastane, když zadaná báze nedokáže přidat do řetězce v odpovídajícím cyklu (Hecker & Rill, 1998). Procento zkrácených produktů nahromaděných v přípravku je tedy určeno účinností syntézy (frakce produktu po celé délce po syntéze) a délkou molekuly. Dlouhé oligonukleotidy, které vyžadují syntézu více cyklů, jsou méně čisté než krátké oligonukleotidy. Tato selhání mohou v některých aplikacích konkurovat celoplošnému produktu a mohou vyžadovat odstranění před použitím oligonukleotidu. Nicméně, odsolený oligonukleotid přípravky jsou obvykle vhodné pro mnoho aplikací, jako jsou standardní PCR nebo microarrays, zejména pokud oligonukleotid je < 20 nukleotidů v délce.
doporučuje se další čištění oligonukleotidů delších než 50 bází, protože procento produktu plné délky v přípravku obvykle není vyšší než 80%. Pro náročné aplikace, kde přesné délky oligonukleotid je důležité, jako je gel-shift testy, site-directed mutageneze, sekvenování, výroba klonování adaptéry, nebo first-strand cDNA syntézu, pro výrobu knihovny, další čištění se doporučuje i pro kratší oligonukleotidy (viz další informace na výše uvedené techniky na Standardní Testy in vitro na Bílkoviny-Nukleové Kyseliny Interakcí – Gel shift Testy pro RNA a DNA Závazné a Site-Directed Mutageneze).
čištění může být vyžadováno po syntéze nebo po enzymatické modifikaci oligonukleotidu. Existuje několik způsobů, jak toho dosáhnout, a výběr závisí na povaze oligonukleotidu a aplikaci, pro kterou je určen.
čištění HPLC v reverzní fázi je založeno na hydrofobnosti. Používá nepolární stacionární fáze a vodné pufry a organická rozpouštědla jako mobilní fáze se eluovány analyty; polární sloučeniny jsou eluovány jako první, zatímco nepolární sloučeniny jsou zachovány. Jedná se o nejlepší způsob čištění oligonukleotidů modifikovaných hydrofobní skupinou, jako jsou biotin, štítky fluorescenčních barviv nebo konjugace NHS-esterů. Hmotnostní regenerace je vyšší než při použití čištění stránky a je přístupná čištění většího množství oligonukleotidů (mmol stupnice), i když neodstraňuje neúplné produkty tak účinně. Purifikační kazety oligonukleotidů, založené na chromatografii s reverzní fází, poskytují rychlou metodu odsolování a čištění oligonukleotidů.
Polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) řeší oligonukleotidů podle jejich délky, a tím nabízí dostatečné rozlišení pro rozlišení full-length výrobky z neúspěšných molekuly (Atkinson a Smith, 1984). Polyakrylamidové gely jsou účinnější pro separaci malých fragmentů DNA, než agarózovém gelu (viz Analýza RNA pomocí analytické polyakrylamidovém gelu elektroforéza a Elektroforéze v Agarózovém Gelu). Jedinou nevýhodou polyakrylamidových gelů je to, že je obtížnější je připravit a zvládnout než agarózové gely. Polyakrylamidové gely jsou provozovány ve svislé konfiguraci v konstantním elektrickém poli. Po elektroforéze je oligonukleotid eluován z gelu a koncentrován pomocí srážení ethanolem (více o srážení nukleových kyselin na metodách čištění RNA-srážení) nebo reverzní fázové chromatografie. Jedná se o způsob volby, kdy je pro náročné aplikace žádoucí nejvyšší procento oligonukleotidů v plné délce. Důrazně se také doporučuje pro oligonukleotidy delší než 30 bází. Také několik vzorků může být spuštěno současně a není nutné žádné drahé vybavení. Jedinou nevýhodou této techniky je malé množství oligonukleotidu získaného na čištění. Typicky, oligonukleotidy jsou používány v měřítku 1 µmol nebo méně, a obnovení hmotnosti po STRÁNCE čištění je < 50% a ještě nižší v případě modifikovaných oligonukleotidů. Přestože je výtěžek nízký, je uspokojivý pro většinu biochemických aplikací.
oligonukleotid příprava je naloženo na denaturačním polyakrylamidovém gelu v množství nejméně 1 mg v jednom jízdním pruhu. Rozsah rozlišení gelu závisí na koncentraci polyakrylamidu. Pro krátké oligonukleotidy (od 15 do 35 bází) se doporučuje 13-15% polyakrylamidových gelů, pro delší oligonukleotidy (od 35 do 70 bází) se doporučuje 8-13% polyakrylamidových gelů. Procento gelu by mělo být přizpůsobeno běžícímu systému. Obvykle používáme systém Bio-Rad Mini Protean II a provozujeme 15% gely k čištění oligonukleotidů o délce 25 bází. Po identifikaci správného pásku pomocí UV vizualizace je pás vyříznut a extrahován z gelu.
dvě různé metody čištění oligonukleotidů z polyakrylamidových gelů jsou popsány v této kapitole. Nejjednodušší metodou je eluce pomocí difúze. To je založeno na pohybu molekul z oblasti s vyšší koncentrací do oblasti s nižší koncentrací. Výsledkem difúze je postupné míchání materiálu. Tato metoda je časově náročná, ale nevyžaduje příliš mnoho práce ani vybavení. V zásadě je polyakrylamidový pás obsahující zajímavý oligonukleotid nakrájen na malé kousky a pokryt elučním pufrem. Po inkubaci se DNA čistí ze supernatantu srážením ethanolu. Výtěžek je omezen, mezi 20% a 70%, v závislosti na délce oligonukleotidu. Čím větší je použité množství elučního pufru, tím více oligonukleotidu je difundováno z gelu.
druhou metodou je elektroelekce do dialyzačního vaku (McDonell et al., 1977). Gelová část obsahující oligonukleotid se vyřízne a umístí do dialyzačního vaku s pufrem. Aplikace elektrického proudu způsobí, že DNA migruje z gelu do pufru dialyzačního vaku. Oligonukleotid se z tohoto pufru získává a čistí. Při použití této metody může být oligonukleotid izolován s dobrým výtěžkem, i když je časově náročné, pokud je současně čištěno velké množství vzorků, protože vyžaduje vložení každého gelového pásma do jednotlivých dialyzačních vaků. Tato metoda také funguje dobře pro větší fragmenty DNA a může být dokonce použita k extrakci DNA z agarózových gelů.