Frontiers in Neuroscience

Úvod

V devatenáctém století, ≈80 let po objevení laktátu (La) Scheele (Kompanje et al., 2007), Louis Pasteur si všiml, že fakultativní buněk kvasinek rostla více, než aerobní anaerobní podmínky, přesto spotřeba cukru se snížila a kvašení na alkohol byl méně za aerobních podmínek (Pasteur, 1861). Dříve Pasteur (1858) uznal, že některé druhy kvasnic fermentovaného cukru na La-za anaerobních, ale ne aerobních podmínek. Tento jev (jak pro alkohol, tak pro La-fermentaci) se nazývá Pasteurův efekt (Barnett a Entian, 2005). Paralelní jev byl objeven u kosterních svalů a celých zvířat. Pro kosterní sval Fletcher a Hopkins (1907) uvedl, že La-nahromaděné v anaerobních žabích svalů v klidu. Během stimulace, La− koncentrace () prudce vzrostla v anaerobní obojživelníků svalů, ale zmizel, když tyto unavené svaly bylo umožněno získat v kyslíku (O2) v bohaté prostředí. Následně, Meyerhof prokázal jednoznačně, že glykogen byla předchůdcem La− v izolovaných svalů, a plné glycolytic pathway byl objasněn na počátku roku 1940 (Meyerhof, 1942; Brooks a Potěšit, 2003). Tradiční dogma bylo postaveno na tomto rámci a dalším výzkumu hypoxie: Pyruvát je konečným produktem glykolýzy za aerobních podmínek a La-je konečným produktem, když je O2 nedostatečný. Schurr (2006) diskutoval o tomto dogmatu z hlediska metabolismu mozku.

je všeobecně známo, že intracelulární PO2 hodnot ≈0.5 Torr nebo méně v důsledku O2-omezené oxidativní fosforylace, stav zvaný dysoxia (Connett et al., 1990), s následnou La-výrobou a akumulací. Stainsby a Welch (1966) však hlásili la-eflux z zdánlivě dobře okysličeného stahujícího svalu. Následně, Jöbsis a Stainsby (1968) pozorován La− produkce a vydání ze smluvní psí kosterním svalu, zatímco NAD+/NADH + h + redoxní pár byl stále více oxidované, údaj o adekvátní nabídky O2. Pomocí jiný přístup, myoglobin cryomicrospectroscopy, určit PO2 v pes gracilis svalu na postupně rychleji, Connett et al. (1986) zjistil rostoucí La-eflux bez důkazu dysoxie; nejnižší hodnoty PO2 byly obecně řádově 2 Torr. Richardson a kol. (1998) používá protonové magnetické rezonanční spektroskopie (MRS) stanovení myoglobinu sytost (a tím intracelulární PO2) u lidí během odstupňované cvičení. V paralelních experimentech se stejným typem cvičení byl la-eflux stanoven pomocí arteriovenózních koncentračních rozdílů a průtoku krve. Našli La-eflux v přítomnosti intracelulárních hladin PO2 (~3 Torr), které by neměly omezovat oxidační fosforylaci. Véga a spol. (1998) také uvádí, že izolovaná, stimulovaná nervová tkáň uvolňuje laktát během aerobních podmínek.

Tato zjištění, spolu s jinými bohaté nepřímé důkazy naznačují, že čisté La− výroba a eflux z buňky může dojít v aerobních podmínkách (Gladden, 2004a,b). Ve skutečnosti Brooks (2000) navrhl, že “ laktát byl produkován po celou dobu v plně okysličených buňkách a tkáních.“Shoreovou – (2006) projednala tento návrh v detailu, což naznačuje, že „glykolýza probíhá vždy na její poslední krok, LDH reakce a tvorba laktátu“ v mozkové tkáni, ale s největší pravděpodobností v mnoha jiných tkáních. Následně, Shoreovou-a Payne (2007) a Shoreovou-a Gozal (2012), pokud podpůrná experimentální důkazy pro tento postulát v hippokampu mozku plátky. Zde přijímáme tento koncept a navrhujeme, že i při absenci čisté akumulace La a za přítomnosti hojného O2 je La přirozeným konečným produktem glykolýzy. Důležité je, že používáme základní biochemické principy, abychom tento koncept podchytili a znovu zavedli laktátový raketoplán Cytosol-mitochondrie.

LDH Reakce je v Blízkosti Rovnovážné Reakce,

La− je tvořen v následující reakce, která je katalyzována pomocí enzymu laktát dehydrogenázy (LDH):

rovnovážná konstanta je silně ve prospěch La− (1.62 × 1011 M−1) (Lambeth a Kushmerick, 2002), a LDH aktivita je vysoká v poměru k předpokládané regulační enzymy v glycolytic pathway v kosterním svalu (Connett a Sahlina, 2011), játra, ledviny, srdeční sval, slezina a tuku (Shonk a Boxer, 1964), mozku (Iwangoff et al., 1980; Morland et al., 2007) a maligní i benigní nádory prsu (Larner a Rutherford, 1978; Balinsky et al., 1984). Důležité je, že aktivita LDH je také vysoká ve srovnání s domnělými regulačními enzymy oxidace pyruvátu; viz Spriet et al. (2000) pro kosterní sval, Morland a kol. (2007) pro mozek a Marie a Shinjo (2011) pro rakovinu mozku. Zatímco poměry tkáňového La-pyruvátu jsou vzácné, některé příkladné hodnoty jsou ≈7:1 pro játra (Liaw et al ., 1985), ≈10-13: 1 pro odpočinek kosterního svalu (Sahlin et al., 1976; Liaw et al., 1985) a hodnoty až 159:1 v kosterním svalu bezprostředně po vyčerpávajícím dynamickém cvičení (Sahlin et al ., 1976). Referenční hodnoty pro poměr La-k pyruvátu v mozku, pomocí mikrodialyzačních sond, průměr 23:1 (Reinstrup et al ., 2000; Sahuquillo a kol., 2014). Obvykle se poměr zvyšuje po traumatickém poranění mozku, a to i v nepřítomnosti ischémie nebo nízké tkáně PO2 {≥ 25 (Sahuquillo et al., 2014); ≥40 (Vespa a kol., 2005)}. Navzdory standardizaci technik nemusí hodnoty mikrodialýzy nutně odrážet skutečné koncentrace tkáně (Sahuquillo et al ., 2014). Nicméně, tyto La− pyruvát microdialysis hodnoty pro lidský mozek nejsou daleko od hodnoty (≈13:1) získané na krysí mozkové homogenáty (Ponten et al., 1973). Celkově vysoká vzhledem k tomu, že i při dostatečné dodávce O2 posiluje roli LDH aktivity při určování La-vzhledu. Vysoké LDH aktivity a La-opírající rovnovážná konstanta LDH reakce jsou klíčové prvky v tvrzení, že La− je hlavní koncový produkt glykolýzy v podstatě všechny metabolické podmínky. Jednoduše řečeno, kdykoli je glykolýza funkční, bez ohledu na místní napětí kyslíku, La-se vytváří ve většině typů tkání. Zvýšené) může být změněno faktory, jako je napětí O2, rychlost metabolismu, dostupná mitochondriální aktivita a další faktory.

osudy pyruvátu

potenciální osudy pyruvátu jsou uvedeny níže. Navrhujeme, aby se žádný z těchto procesů nevyskytoval rychlostí, která odpovídá počáteční konverzi pyruvátu na La -, čímž je zajištěno, že La-je vždy konečným produktem glykolýzy.

1. Eflux z buňky primárně přes monokarboxylátové transportéry (MCT). La-je však vždy přítomen ve vyšší koncentraci než pyruvát a odchází buňky rychleji než pyruvát.

2. Přeměna na alanin prostřednictvím téměř rovnovážné reakce alaninaminotransferázy, která má rovnovážnou konstantu asi 1 (Tiidus et al ., 2012), takže koncentrace alaninu by se měla přiblížit koncentraci pyruvátu a přeměna pyruvátu na alanin by neměla snižovat přeměnu pyruvátu na La -.

3. Glukoneogenní / Glykoneogenní reakce. V glukoneogenních tkáních může být pyruvát přeměněn na oxaloacetát v reakci katalyzované pyruvátkarboxylázou(Pascoe a Gladden, 1996). V kosterním svalu glyconeogenesis, pyruvát může být přeměněn na malát s katalýzou tím, enzym, kyselina jablečná (Pascoe a Potěšit, 1996), nebo více pravděpodobné, že fosfoenolpyruvátu prostřednictvím obrácení pyruvát kinázy reakce (Donovan a Pagliassotti, 2000). Tyto reakce představují „obrácení“ glykolýzy a začínají La -, přirozeným konečným produktem glykolýzy. V mozku je glykogen nejhojnější v astrocytech a řídký až zanedbatelný v neuronech (Cataldo a Broadwell, 1986). Ačkoli pyruvátkarboxyláza je exprimována v kultivovaných astrogliálních buňkách, oligodendrocytech, mikrogliálních buňkách a ependymocytech (Murin et al., 2009), nevíme žádné informace o schopnosti kterékoli z těchto buněk syntetizovat glykogen z La -.

4. Transport přes vnitřní mitochondriální membránu s následným přepočtem na Acetyl-CoA přes pyruvát dehydrogenázy (PDH) reakce následuje vstup do trikarboxylová cyklu a oxidace. Pyruvát prochází vnitřní mitochondriální membránou jednoduchou difúzí a usnadněnou difúzí; transportéry jsou MCT (Hashimoto et al., 2006) a nosič mitochondriálního pyruvátu (Divakaruni a Murphy, 2012). Pro pokračující oxidaci pyruvátu, nadh penalizace do mitochondriální matrice pomocí raketoplánů malát-aspartát a glycerol fosfát je stejně důležitá jako transport pyruvátu.

konstantní přítomnost La-a její akumulace během období glykolytické stimulace je důkazem, že LDH reakce převažuje nad těmito alternativními osudy pyruvátu.

Obrázek 1 znázorňuje model intracelulární metabolismus, který nazýváme „Cytosolu do Mitochondrií Laktát Raketoplán“; jeho původ lze vysledovat do recenze La− metabolismus Stainsby a Brooks (1990). Vzhledem k vysoké aktivitě LDH a rovnovážné konstantě daleko ve směru La -, La-je vždy převládajícím výsledkem glykolýzy. Nicméně, tvorba La – není synonymem pro la-akumulace a zvýšil . Mitochondrie představují dřez na pyruvát a za podmínek pomalé glycolytic činnost s dostatek O2, oxidace ve většině buněk je dostatečná, aby odpovídaly výroby glykolýza; transmembránový La− flux se bude lišit mezi pomalým uvolňováním a pomalým příjmu s uvolňováním je více typický stav. Analogicky jako kreatin kinázy a Kreatinfosfát Kyvadlová doprava, LDH drží pyruvát a La− v rovnováze v průběhu celého buněčného cytosolu. V tomto scénáři, La− je základní druhy, které se šíří do okolí mitochondriální retikulum, s největší pravděpodobností do mezimembránového prostoru, kde LDH je připojen k vnější straně vnitřní mitochondriální membrány (Hashimoto et al., 2006; Gladden, 2008). Tady, La-je převeden na pyruvát pro vstup do mitochondrií, vzhledem k relativnímu „dřezu“ pro pyruvát. Současně se regeneruje NADH z obrácení LDH reakce a jeho elektronový pár je převážen přes vnitřní mitochondriální membránu do malát-aspartát a glycerol fosfátu raketoplány. Důležitý rozdíl od Kreatinfosfát Raketoplánu je, že dvě klíčové komponenty, La− a pyruvát, na rozdíl od kreatinfosfát, mohou překročit plazmatické membrány a opustit buňku.

Cytosolu do Mitochondrií paradigma předpokládá, že La− je vždy vytvořené během glykolýzy, i když La− není hromadí a je stabilní. Samozřejmě, pokud je O2 tak nízká, že je inhibována oxidační fosforylace, pak produkce La překročí rychlost, při které oxidační metabolismus může používat pyruvát a NADH, což způsobuje a la-eflux stoupá. Také, pokud se glycolytic aktivita se zvyšuje i s dostatek O2 úrovně, jako v kosterním svalu při mírné intenzitě nebo možná v aktivovaných astrocytů (Pellerin a Magistretti, 2011), La− produkce nebude doprovázena oxidace pyruvátu a bude stoupat, jak bude doprava La− ven z buňky. Podobně, pokud glycolytic aktivita enzymu je rozšířené a/nebo mitochondriální funkce (oxidační aktivita enzymu) je downregulated taková, že glykolýza je přednost před oxidací, bude pokračující nesoulad mezi La− výroba a následné pyruvát a NADH + h + oxidace, což má za následek zvýšené a La− eflux. Tato druhá situace je pozorována u rakovinných buněk „Warburg“ (Semenza, 2008) a u pacientů s CHOPN během cvičení celého těla in vivo (Maltais et al., 1996).

s vytrvalostním cvičením se zvyšuje obsah mitochondrií kosterního svalstva (Holloszy a Coyle, 1984) a nyní existuje větší dřez pro pyruvát. Zvýšené mitochondriální oxidační aktivita vyžaduje nižší úrovně stimulátory (např. ADP) pro konkrétní oxidační fosforylace sazby; tyto stejné podněty jsou alosterické stimulátory klíčových glycolytic enzymy, takže glykolýza je snížena. Navíc, pokud La− membránový transport je inhibován, a to zejména v buňkách, které již mají nesoulad, ve kterém glykolýzy je přednost před oxidativním metabolismu, je pravděpodobné, že mobilní poroste s potenciálně škodlivé účinky na buňky (Le vláda pascale et al., 2011). Dále by silná inhibice celkové aktivity LDH v glykolytických buňkách měla zabránit rovnováze a tím snížit produkci La, akumulaci a eflux (Fantin et al., 2006). Účinek změny vzoru LDH isozymu nezávislého na inhibici nebo snížení celkové aktivity LDH však ještě není zcela vyřešen (Downer et al., 2006).

budoucí směry: vliv izoformy LDH a aplikace na metabolismus nádorů

jaký dopad má izoformy LDH a jak by mohly být tyto znalosti aplikovány na léčbu onemocnění se změněným metabolismem, jako jsou rakoviny?

za prvé, LDH je tetramerní enzym složený ze dvou proteinových podjednotek, které celkem přibližně 135 kDa (Cahn et al ., 1962). Na tetramer lze sestavit jako pět samostatných izoenzymy tím, že tvoří všechny kombinace M (muscle) formuláře (produkt Ldh-gen) nebo H (heart) formuláře (produkt Ldh-B genu) výroba: M4 (= A4 = LDH5), M3H1 (= A3B1 = LDH4), M2H2 (= A2B2 = LDH3), M1H3 (= A1B3 = LDH2) a H4 (= B4 = LDH1). Výsledky studií in vitro naznačují rozdílné kinetické vlastnosti s ohledem na afinitu k substrátu a inhibici těchto izozymů. Isozymy ovládané M mají 3,5-7krát vyšší Km-hodnoty pro pyruvát a La-než formy ovládané H. Dále jsou typy H4 inhibovány pyruvátem při koncentracích nad ~0,2 mM, zatímco typy M4 jsou málo ovlivněny koncentracemi pyruvátu až 5 mM (Plagemann et al ., 1960; Stambaugh and Post, 1966; Quistorff and Grunnet, 2011b). Isozym H4 je inhibován nad 20-40 mM, zatímco isozym M4 je méně inhibován vysokým (Stambaugh a Post, 1966). Tyto body byly nabídnuty jako důkazy pro funkční rozdíly v buněčném metabolismu různých tkání se srdcem formy podpory oxidace, zatímco sval formy usnadnit vznik La− (Cahn et al., 1962). Distribuce IZOZYMU LDH nalezená v přírodě odpovídá těmto charakteristikám stanoveným in vitro. Například, fast-škubnutí, glycolytic, typ II kosterní svalová vlákna mají větší podíl M-typ LDH izoenzymové vzhledem k tomu, slow-twitch, oxidační typ I kosterní svaly, stejně jako srdeční sval, mají větší podíl H-typ LDH isozym (Van Hall, 2000). Shodně vytrvalostní cvičení snižuje podíl isozymu LDH typu M ve trénovaných svalech (Van Hall, 2000). V mozku astrocyty (které jsou předpokládá se, že mají vyšší glycolytic metabolismus), mají větší podíl M-typ LDH izoenzymové, vzhledem k tomu, že neurony (což jste tvrdil, že mají vyšší oxidační metabolismus), mají větší podíl H-typ LDH isozym (Shoreovou -, 2006; Pellerin a Magistretti, 2011). U nádorů, glycolytic „Warburg-typ“ buňky mají větší podíl M-typ LDH izoenzymové zatímco více oxidačních rakovinné buňky mají větší podíl H-typ LDH isozym (Semenza, 2008). Takže, nepřímé důkazy LDH izoenzymové distribuce se shoduje s vnímanou funkci LDH isoenzymy, jak je stanoveno in vitro.

výše uvedené důkazy vedly k závěru, že vzor LDH isozymu je příčinným faktorem La metabolismu. Dále objasnit roli rozdělení LDH isozymu jako koordinátora La-metabolismu, Summermatter et al. (2013) provedl šetření vyzkoušet roli peroxisome tiazolidindionom-activated receptor-γ coactivator 1α (PGC-1α) jako regulátor LDH izoenzymové podtyp výraz. Je známo, že PGC-1α je důležitý při koordinaci metabolismu buněčné energie (Wu et al ., 1999). V reakci na různé podněty, PGC-1α stimuluje mitochondriální biogeneze, podporuje přechod z kosterního svalu do více oxidačních fenotyp, a přispívá k změněný metabolismus sacharidů a lipidů (Liang and Ward, 2006).

Summermatter et al. (2013) studovali svalové specifické PGC-1α transgenních myší, stejně jako svalové specifické PGC-1α knockout myší a našel (1) dolní krev v transgenních zvířat, a vyšší krev ve vyřazovací zvířat v reakci na vytrvalostní cvičení, a (2) snížená exprese M-typ LDH v transgenních zvířat a snížení H-typ LDH ve vyřazovací zvířat. Tito autoři dospěli k závěru, jak tvrdí jejich název, že “ PGC-1 α kosterního svalu řídí La-homeostázu celého těla prostřednictvím aktivace LDH B závislé na estrogenovém receptoru α a represe LDH a.“Podle jejich názoru je LDH isozyme vzor významným hráčem v celotělovém metabolismu La -.

existují však nedostatečně ceněná upozornění týkající se funkcí LDH isozymu a jejich potenciální role v metabolismu. První, výše zmíněné kinetické vlastnosti pro LDH isoformy byly stanoveny in vitro při 20 nebo 25°C a Km-hodnoty pro pyruvát zvyšuje s teplotou, přibližně zdvojnásobení při 37°C ve srovnání s 25°C (Latner et al., 1966; Quistorff and Grunnet, 2011b). Dříve, Newsholme a Leech (1983), Van Hall (2000), Newsholme (2004), Gladden (2008), a Quistorff a Grunnet (2011a), vyvolaly významné otázky ohledně role LDH izoenzymové profily v La− výroba vs. využití, a upozorňuje, že: (1) enzymy, nemění rovnovážnou konstantu reakce; (2) LDH reakce je blízko rovnováze, čímž se minimalizuje alosterické účinky; (3) rozdíly v LDH izoenzymové funkce in vivo jsou možná poměrně malý, protože vyšší fyziologické teploty a vazby na struktury nebo jiných proteinů; (4) koncentrace La− a pyruvát potřebné pro LDH inhibice in vitro jsou mnohem vyšší než nejvyšší koncentrace pozorované in vivo; a (5) LDH inhibice in vitro může být způsobeno stopy enol formě pyruvátu, které jsou méně pravděpodobné, že být přítomny in vivo.

ačkoli Summermatter et al. (2013) s přesvědčením, že LDH izoformní vzor je hlavním faktorem La-metabolismu celého těla, je v jejich designu fatální chyba. Ignorovali fakt, že PGC-1 α transgenní myši mají zvýšenou mitochondriální proliferaci a oxidativní fosforylace enzymů, vzhledem k tomu, že PGC-1α knockout myši mají výrazné snížení cytochrom oxidáza a citrát syntázy činnosti (Arany et al., 2005). Podle našeho názoru, tyto změny v mitochondriální funkce, již dříve poznamenal, vysoké celkové LDH aktivity, bez ohledu na to, izoenzymové vzor, a v blízkosti rovnováhy přírody této reakce činí závěry Summermatter et al. (2013) neudržitelný. Proto jsme dospěli k závěru, že přesné fyziologické a biochemické role LDH isozymů in vivo je třeba definitivně objasnit.

konečně, pokud jde o metabolismus nádorů, pochopení, že La-je konečným produktem glykolýzy, je rozhodující pro navrhování intervencí pro cílení na rakovinu. Stručně řečeno, experimenty Cori a Cori (1925)a Warburg et al. (1927) ukázal, že nádory vypadaly, že dychtivě konzumují glukózu a produkují La−. Následné dogma v metabolismu nádorů si myslí, že nádory vykazují „Warburgův efekt“, produkující a exportující La -. Nicméně, my nyní víme, že nejen různých typů nádorů, rukojeť La− jinak (některé jsou čisté výrobců; některé jsou čisté spotřebitelů), ale i v rámci jediného nádoru může být pendluje mezi různými typy buněk; buňky do buňky La− shuttle (Semenza, 2008). Mnoho rakovinných buněk je chudými spotřebiteli laktátu (Sonveaux et al ., 2008) vyvolávající spekulace, že hypoglykémie chráněná La může být terapeutická (Nijsten a van Dam, 2009). V kontrastu, některé nádory zaníceně použití La− jako palivo, a reagovat na doplňující La− se zvýšenou proliferaci a prokrvení, pravděpodobně v přímém důsledku upregulace vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) a hypoxií indukovatelných faktor 1α (HIF-1α). V nedávné studii o zvířecím modelu sarkomu Goodwin et al. (2014) uvedl, že La-řídil sarkomagenezi v nepřítomnosti hypoxie. Je úžasné, že naše chápání La-metabolismu u rakoviny zůstává neklidné téměř 90 let po prvních studiích Warburgu.

závěry

naše chápání La-formace se od svého objevu drasticky změnilo. Tradičně se pyruvát považuje za konečný produkt glykolýzy, pokud je přítomen O2, a La-konečný produkt během období dysoxie. Na konci dvacátého století a počátku jednadvacátého století bylo zjištěno, že O2 není omezení oxidativní fosforylace ve většině buněčné podmínky, a La− je to skutečně vyrábí, i když neexistuje žádné omezení na rychlost O2 dodání do mitochondrií. Další úvahy o aktivitu enzymu LDH a rovnovážná konstanta pro reakci předem tvrzení, že La− je hlavní koncový produkt glykolýzy ve většině, pokud ne všechny metabolické podmínky ve většině buněk. Role různých LDH isoenzymy v metabolismu není tak zřejmé, jak většina badatelů, a došli jsme k závěru, že jejich přesná funkce zůstává neobjevených. Zda máme pravdu o cytosol-to-mitochondrie laktátu raketoplán, jak je zde popsáno, a nejistá role IZOFORM LDH bude obtížné vyhodnotit za podmínek in vivo. Jedním z přístupů je modelování v silico. Pochopení přesné mechanismy glykolýzy a La− metabolismus bude nejen prohloubit naše porozumění metabolizmu ve zdravých tkáních, ale bude také půjčovat nahlédnout do nemocných nebo poraněných tkání, s nejviditelnější aplikace je nepříčetný metabolismus sacharidů přítomných v nádorových buňkách (Vander Heiden et al., 2009) a mozkový metabolismus po traumatickém poranění mozku (Brooks a Martin, 2014).

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.