Hodnocení IC50 úrovně bezprostředně po léčbě protinádorových činidel pomocí real‑time mobilní monitorovací zařízení

Úvod

real-time cell-monitoring analysis (RTCA) systemwas dříve vyvinut pro kontinuální monitorování přichycený cellcultures (1). Tento label-free a invazivní metoda je založena na měření electricalimpedance (cell index, CI) mezi interdigitated regionů na základu tkáňové kultury desky. Měření CI poskytujekvantitativní informace o biologickém stavu přívržencůbuněk. Ve skutečnosti je význam CI počet buněk přežití. na povrchu E-desky. Tyto údaje zahrnují číslo buňky, životaschopnost a morfologii jako profil v reálném čase (2-4). RTCAsystem je známo, že zařízení pro včasnou detekci buněčné reakce jako adynamický fenotyp proti některým činidlům (5).

V naší předchozí studii, imatinib cytotoxicity v oralsquamous karcinomu (OSCC) byla hodnocena pomocí WST-8(5– 3-(2- methoxy – 4-nitrofenyl)- 2-(4-nitrofenyl)-2H – tetrazole – 3 – ium) testu jako anendpoint měření (6), a thenlater s RTCA systému (7).Koncový bod měření pomocí MTT (3–2,5-diphenyltetrazolium bromid) a WST-8 testy arecommonly používá k vyhodnocení cytotoxicity. Takové testy jsou však omezeny změnami účinků různých protinádorových činidel na různých buněčných liniích. Kromě toho mají hodnoty IC50 vypočtené in vitro testy cílových parametrů tendenci být vyšší než účinné koncentrace in vivo (8,9).

V naší předchozí studii, IC50 valuesmeasured podle RTCA systému byly nižší než ty měřené theWST-8 testu, což naznačuje, že RTCA systém může sensitivelyevaluate cytotoxicity a vlivu imatinibu na celladhesion. Nicméně, to je nejasné, zda hodnocení theIC50 hodnoty jiných protinádorových látek pomocí RTCAsystem by být užitečné, protože tam jsou rozdíly v cytotoxicreactions mezi molekulární cílené léky, jako je imatinib andanticancer agentů v průběhu času.

V této studii, musíme vybrat nějaký typ ofcell čáry za účelem zjištění rozdílu buňky reactionprofile proti protinádorových činidel v reálném čase pomocí systému RTCA.Neinvazivní SQUU-buněčné linie a invazivní SQUU-B buněčné linie, které zřízen z místní opakující se jazyk rakovinových nádorů v jeden pacient, byly vybrány, protože jsme byli zapojeni do získávání metastázy SQUU-B buněčné linie pomocí SQUU-buněčné linie a SQUU-Bcell line (10-12). SAS buněčná linie byla stanovena zšpatně diferencovaný lidský spinocelulární karcinom jazyka (13). Byla vytvořena buněčná linie najako buněčná linie produkující fibronektin (14). Navíc, to bylo hlásil, že cytotoxicita protinádorových činidel v OSCC byl evaluatedin SQUU-buněčné linie a SQUU-B buněčné linie (15), SAS buněčné linie (16), NA buněčné linii (17) pomocí různých konvenčních metod.Proto jsme v této studii vybrali čtyři tyto buněčné linie s každou charakteristickou vlastností, které byly také použity v cytotoxickém testu v předchozí studii.

V této studii jsme se zaměřili na nové RTCA devicedeveloped pro real-time měření a vyhodnocovat theIC50 hodnoty jako měřítko k posouzení cytotoxicity čtyř protinádorových látek směrem ve čtyřech OSCC buněčných linií. To nám umožnilo získat informace o pozorovaných variacích mezi různými protinádorovými činidly a buněčnými liniemi v reálném čase.

cílem této studie bylo získat 50 profilů ihned po přidání antikancerózních látek pomocí systému RTCA. Tato studie prokázala výhodu hodnocení cytotoxicity protinádorových látek pomocí systému RTCA ve srovnání s testem koncových bodů.

Materiály a metody,

Činidla a materiály,

5-Fluorouracil (5-FU) byl naředěn do 100 mM indimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St.Louis, MO, USA).Doxifluridin a karboplatina byly zředěny na 100 a 50 mM v destilované vodě. Docetaxel byl naředěn na 10 mM inethanolu. Všechna protinádorová činidla pocházela z Wako PureChemical Industries, Ltd., (Ósaka, Japonsko) a při -20°C.

buněčná kultura

lidské OSCC buněčné linie SQUU – A, SQUU-B, SAS a nabyly odvozeny ze vzorků lidského jazyka. SQUU – A a SQUU-B, které byly poskytnuty Morifuji-Wilson M (Kumamoto University, Kumamoto, Japonsko), byly založeny z lokálních recidivujících nádorů rakoviny jazyka (18). SAS (13,19,20) byl zakoupen od buněčné banky Riken BRC (Tsukuba, Japonsko). NA (14) byl laskavě poskytnut Dr. Jun-ichi Iwata (Kyushu University; Fukuoka, Japonsko). Všechny buněčné linie byly udržovány v médiu Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kjóto, Japonsko) obsahující 10% fetálního telecího séra (Biowest, Nuaille, Francie) při 37°C ve zvlhčené atmosféře S5 % CO2.

měření proliferace buněk OSCC testem cytotoxicity RTCA

CI bylo získáno systémem iCELLigence (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, USA) jako systém RTCA. Allmonitoring byl prováděn při 37°C s regulovaným obsahem Co2c (5%). E-destičky (kultivační destičky pro systém iCELLigence)obsahující 200 µl kultivačního média na jamku byly vyrovnány na 37°C a CI bylo za těchto podmínek nastaveno na nulu. Buňky (2×104 buněk / jamka, pokud není uvedeno jinak) byly přidány do 560 µl kultivačního média protinádorová činidla byla přidána 24 hodin po zasetí buněk. CI byl sledován v reálném čase po dobu 96 hodin po výsevu buněk. Hodnoty IC50 byly vypočteny RTCAData Analysis Software Verze 1.0 (ACEA Biosciences, Inc .).

Osmibodová koncentrace čtyř antikancerreagentů byla stanovena na základě hodnot Cmax v předchozí studii (21-25). Dále byly stanoveny časové body v průběhu 72 h včetně 24 h a 48 h, což byla obecná metoda pro hodnocení cytotoxicity v konečném bodě.

Křivky z IC50data

Jsme použili následující sigmoidal dose-responseformula pro výpočet hodnoty IC50: Y=Nízké CI + (HighCI-Nízké CI)/{1+10 ^ (Log IC50-X)}, kde Nízké CI’represents minimální CI hodnoty, ‚High CI‘ představuje maximumcell index hodnoty, Y je buňka index, a X je log ofconcentration (M).

měření proliferace buněk OSCC pomocí testu WST-8

po počátečním setí a kultivaci buněk OSCC bylo kultivační médium odstraněno a nahrazeno médiem obsahujícím antikanceragent. Po 24, 48 a 72 hodinách inkubace bylo do každé jamky přidáno 20 µl barviva WST-8 (sada pro počítání buněk-8; Dojindo Corporation, Tokio,Japonsko). Po 3 hodinách byly desky načteny na450 nm / 655 nm. Míra přežití buněk byla vypočtena za použitíformula níže (7). Hodnoty IC50 byly vypočteny lineární aproximační regresí přežití percentage versus koncentrace léčiva.

míra přežití buněk (%) =(a-c) / (b-c) ×100 (a=absorbance při každé koncentraci protinádorového činidla, b=absorbance při 0 µM protinádorového činidla a c=absorbance polotovaru).

Statistická analýza

všechna data jsou zobrazena jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) tří nezávislých experimentů. Korelace mezi hodnotami IC50 získanými pomocí systému RTCA a testem WST-8 byly hodnoceny pro statistickou významnost Spearmantest. Dvouocasé hodnoty p<0,05 byly považovány za přiřazující.

Výsledky

Účinek protinádorových agentconcentration na OSCC buněčné proliferace pomocí systému RTCA

hodnocena cytotoxicita čtyři anticancerreagents (5-FU, doxifluridine, karboplatina, a docetaxel) v fourOSCC buněčné linie sledováním CI hodnoty pro 96 h po thecells byla ohlášena na 2×104 buněk na jamku na E-desky(Obr. 1–4). Hodnoty CI byly sníženy v závislosti na adóze ve všech čtyřech buněčných liniích OSCC. Proto snížení hodnot CI korelovalo s poklesem buněk number.As znázorněno na obr. 2, hodnota CI proinvazivní buněčnou linii SQUU-B byla nižší než u jiných OSCC cells.As znázorněno na obr. 3, profil CI získaný pro buněčnou linii SAS vykazoval zpožděné zvýšení po 48 hodinách. 4, Rychlost proliferace a maximální hodnota CI v buněčné linii NA byly vyšší než jedenjiných buněčných linií.

Real-time měření theIC50 profily protinádorových látek v OSCC buněk pomocí systému RTCA

IC50 profily ze čtyř anticancerreagents ve čtyřech OSCC buněčné linie byly určeny RTCAsystem a vypočítá komerční software za předpokladu, s přístrojového (podmnožina SQUU-B údaje jsou uvedeny na Obr. 5). Hodnoty IC50 bylyplotovány po dobu 72 hodin po přidání protinádorových látek. Aic50 hodnoty při 24, 48 a 72 h pro všechny čtyři buněčné řádkyjsou shrnuty v tabulkách I-IV. jak je znázorněno na obr. 5, došlo k časovému zpoždění v cytotoxickéreakce 5-FU (obr. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Table I.

IC50 values of 5-FUdetermined with the RTCA system after 48, 72, and 96 h incubationin OSCC cells.

Table IV.

IC50 values of docetaxeldetermined with the RTCA system after 48, 72 and 96 h incubation inOSCC cells.

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Zatímco křivky životaschopnosti buněk ofSQUU-B pomocí testu WST-8 byly také ukázány v doplňkových materiálech(obr. S5-S8). R2 hodnoty na 72 h afteraddition protinádorových činidel v WST-8 testu byly nízké v fouranticancer činidla, ve srovnání s 24 h a 48 h. Theseresults ukázal, že je žádoucí, aby end-point assay beperformed na 24 h nebo 48 h, aby být použit jako obecný protokol. V této studii byly křivky životaschopnosti buněk testu WST-8 ukázány v doplňkových materiálech, protože neexistovala žádná novinka v tom, jak vypočítat hodnoty IC50 pomocí testu WST-8.

Korelace mezi real-timemeasurements z hodnoty IC50 pomocí systému RTCA andendpoint měření hodnoty IC50 pomocí WST-8assay v OSCC buňky,

, Jak je znázorněno na Obr. 6, hodnoty IC50 při 24, 48 a 72 h pomocí dvou metod byly vykresleny. Vodorovná osa ukazuje hodnoty IC50 měřené v reálném čase pomocí systému RTCA, zatímco podélná osa zobrazuje hodnoty IC50 v bodě Endpoint měřené pomocí testu WST-8. Byla pozorována apozitivní korelace mezi těmito dvěma typy testu k měření IC50 pro každé protinádorové činidlo.Výsledky 5-FU, doxifluridine, karboplatina, a docetaxcelwere y=8.19 x+346.02 (R2=0.94,r=0.66, *P<0.05), y=1.00 x+172.70(R2=0.91, rs=0.82, **P<0.01),y=1.90 x+206.81 (R2=0.92,r=0.96, **P<0.01), andy=13.53 x+0.08 (R2=0.95,r=0.73, *P<0.05), resp. Hodnoty real-timeIC50 bývaly nižší než odpovídající hodnoty IC50.

diskuse

hodnoty CI vypočtené RTCA také reprezentují stav buňky (3). Osel na obr. 1-5, SD hodnoty hodnot CI byly příliš malévidět. Například všechny hodnoty SD na obr.1 byly pod 0,05. Důvodem pro nízké CI hodnoty SQUU-B wassuggested, že přilnavost protein E-cadherin hraje essentialrole v metastáz, s nižší úrovní E-cadherinu promotingcell migraci a buněčné invaze (26). Důvodem vysokých hodnot max CI ofNA bylo navrženo, že bylo hlášeno, že fibronektin zrychlil buněčnou proliferaci a adhezi v důsledku funkce buněčné linie ofNA jako buněčné linie produkující fibronektin (6). Buněčné reakce každé buněčné linieproti čtyřem protirakovinovým činidlům byly variabilní. V této studii jsme nemohli najít příčinný vztah mezi hodnotami IC50 a funkcí buněčných linií. Je však důležité zjistit buněčnou reakci v reálném čase jako profil CI k vyhodnocení cytotoxicity protinádorového činidla při zvažování farmaceutické aplikace na člověka.

profil IC50 buněčné linie SQUU-B bylpopsáno na obr. 5 jako účastní zástupce IC50 profil, protože tam byly nodifferences IC50 profilu vzor ve stejné buněčné linie zapouzdřit stejné činidlo, i když jsme vypočtena IC50 hodnoty všechny buněčné linie pomocí čtyř protinádorových činidel. Zjistili jsme, žeic50 profily se lišily pro každé protinádorové činidlo a pro každou buněčnou linii OSCC. Jak je znázorněno na obr.5, 5-FU a docetaxelu vyžaduje více než 24 h (48 h v thefigure) začít vyvíjet cytotoxický účinek na OSCC buňky,vzhledem k tomu, že hodnoty IC50 se zotavil z asi 24 h(48 h na obrázku) po přidání doxifluridine andcarboplatin. Navrhli jsme tedy, že rozdíly profilů v reálném časeic50 byly způsobeny protinádorovým činidlem. Taková pozorování by nebyla možná bez měření v reálném čase pomocí RTCA. Sledování hodnot theIC50 v reálném čase také ukázalo, že se tyto hodnoty v průběhu času výrazně měnily. Existuje možnost nezjistitzměny pomocí konvenčních metod, protože pouze jeden časový bod IC50 po léčbě protinádorovým činidlem je vyhodnocen testem koncového bodu.

RTCA systém je na rozdíl od tradičních endpointassays být, protože měření impedance je neinvazivní a lze je poskytovat vysoce kvalitní, kvantitativní údaje o cytotoxicitě v soustavné způsobem. Jak je znázorněno na obr.6, existovaly významné pozitivní korelace mezi hodnotami IC50 získanými se systémem RTCA a testem WST-8, i když existovaly určité rozdíly v absolutních hodnotách CI, jako jsou nízké hodnoty CI získané pro buněčnou linii SQUU-B. Tyto výsledky naznačují, že i nízká CI získaná pro některé buněčné linie by byla schopna vyhodnotit cytotoxicitu vysoká citlivost v Rtcasystému. Zatímco hodnoty IC50 v reálném čase byly nižší než hodnoty Endpoint IC50, když byly hodnoty IC50 v reálném čase získané systémem RTCA porovnány s hodnotami Endpoint IC50 získanými pomocí testu WST-8.Tyto výsledky naznačují, že systém RTCA lze použít necitlivě vyhodnotit účinek protinádorových látek na buněčnou proliferaci a adhezi.

v systému RTCA působí adherentní buňka jako izolátorpovrch elektrody a mění iontové médium roztoku elektrody, čímž se zvyšuje impedance (27). CI je tedy funkcí buňkypočet a poměr buněk v různých časových intervalech. CI=0, kdyžneexistuje adheze buněk (5). CIchanges popsané systémem RTCA jsou odrazem dynamického fenotypu buňky. Tyto dynamické sledování interakce buňka-lék nám umožňujezískat lepší pochopení časových účinků invitro, zejména bezprostředně po léčbě lékem (28). Kinetická funkce thecells nabízí zasvěcené informace, které nelze získat z konvenčního testu s jedním koncovým bodem, jako je test WST-8. Zatímco výsledky testu WST-8 se odráží metabolická reakce survivalcell (29). Toxicita při použití testu WST-8 může být podhodnocena, pokud by buněčná metabolická reakce byla zachována, i když došlo k dynamické buněčné reakci. Navrhli jsme, že tyto rozdíly principal ve dvou metodách byly indukovány aobrovské rozdíly hodnoty IC50 až 8krát mezi dvěma metodami, jak je znázorněno na obr. 6A. Ourpředchozí studie uvádí, že IC50 imatinibu v SQUU-Acells vypočtených RTCA systémem a WST-8 testem byly 4 µM a 60 µm (citlivost 15krát) (6,7). Otherresearch skupin uvedlo, že IC50 cisplatiny v HK-2cells vypočítá podle RTCA systému a WST-8 testu byly 0.76 µM a 25µM, respektive (citlivost 33 krát) (30,31).Tato předchozí data podporovala naše data, aby ukázala platnost.

je důležité získat měření fromimmediately po zacházení s protinádorovými léky posoudit cí vedlejší účinky agentů a žádoucích účinků. Existuje však jen málo zpráv o užitečných metodách, které korelují data invitro s lidskými daty in vivo. Domnívali jsme se, že měření v reálném čase pomocí systému RTCA by prospělohodnocení vedlejších účinků protinádorových látek v normálních buňkách.

Dříve hlášeny hodnoty Cmax 5-FU,doxifluridine, karboplatina, a docetaxel jsou 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), a 2 µM (24,25),respektive, pokud se používají pro intravenózní léčby u lidí. Ourdata korelovala s lidskými údaji, protože hodnoty Cmax byly zahrnuty do rozsahu experimentálních dávek použitých v této studii.

RTCA systémy jsou nové hlavní zařízení, ohodnotit, cytotoxicita, které zaměstnávají impedance intenzita celladhesion a ne enzymové aktivity v cílových buňkách, například MTTassay. Hodnoty IC50 protinádorových látek vypočtené systémem RTCA byly významně korelovány s hodnotami IC50 vypočtenými konvenčním testem koncových bodů. Kromě toho systém RTCA získal měření automaticky v reálném časeod bezprostředně po léčbě protinádorovými látkami.

ve skutečnosti systém RTCA nemůže vyhodnotit přímo konkrétní cytotoxicitu, jako je buněčná smrt nebo apoptóza atd., protože index buněk byl vypočítán na základě impedance. Proto může být kombinovaný test mezi systémem RTCA a měřením buněčné smrti účinnou metodou v případě vyhodnocení konkrétní buněčné reakce, jako je buněčná smrt nebo apoptóza přesně.Například, Annexin V, barvení nebo exprese kaspázy-3 assayfor detekce apoptózy, Laktát Dehydrogenázy (LDH) releaseassay pro detekci buněčné smrti může být efektivní metody(32,33). Dále by mohlo být užitečné ohodnotit, exprese zánětlivých proteinů v normálních buňkách fordetection vedlejší účinek, když anti-rakovina činidlo bylo přidáno do thenormal buněk nasazených na E-desce. Dynamické monitorování v reálném čase duringcell kultury včetně protinádorových činidel může poskytnout valuableinsights pro včasné zjištění terapeutické účinnosti a sideeffect, které nelze hodnotit v konvenční metody v end-pointassay. Takže, IC50 hodnota vypočtená podle RTCA systém by mohl být to je užitečné parametr pro takové jako screening z hlediska pravých-time měření v automatické, vyhýbání se colorimetricallyproblems nebo kontaminace. Kromě toho systém RTCA umožňuje analýzu celého období experimentu a nevyžaduje označení, které může negativně ovlivnit buněčnou kulturuexperimenty.

novinkou této studie je, že systém RTCA by mohlzjistit cytotoxicitu vysokou citlivost ve srovnání s konvenčnímmetoda, test WST-8. Systém RTCA by navíc mohl hodnotitic50 hodnotu v reálném čase bez omezení experimentálního období po dobu nejméně 72 hodin po přidání anticancerových činidel.

Na závěr naše výsledky prokázaly, že RTCAsystems jsou užitečné pro test cytotoxicity a mohl by být použit infuture vývoj chemoterapeutik pomocí rakovinu cellsand hodnocení jejich vedlejší účinky na normální buňky. Kromě toho lze systém RTCA použít k vyhodnocení profilů buněčné reakce, jako je kombinovaná terapie a interakce protilátek-buněk nebo léků-drog, protinádorových činidel.

doplňkový materiál

podpůrné údaje

potvrzení

neplatí.

financování

žádné financování nebylo přijato.

dostupnost dat a materiálů

datové sady použité a / nebo analyzované během presentstudie jsou k dispozici od odpovídajícího autora na reasonablerequest.

příspěvky autorů

MH A MN koncipovaly a navrhly studii. MH andTN provedl experimenty a získal data. MH analyzovala data, připravila čísla a vypracovala rukopis. MH, TKY andMN interpretovaly výsledky. MH a TKY upravily a revidovaly themanuscript. Všichni autoři přečetli a schválili finálmanuskript.

etické schválení a souhlasúčast

neuplatňuje se.

souhlas pacienta se zveřejněním